项目文章｜单细胞RNA测序联合单细胞蛋白质组学鉴定小鼠胰岛细胞亚群对高脂饮食的代谢

期刊：Diabetologia（IF=10.460）

技术服务：单细胞RNA测序、单细胞蛋白组测序（由上海伯豪生物提供技术服务）

导语

胰岛是一种包含多类细胞的精密微小器官，其中α、β和δ等内分泌细胞参与机体血糖稳态的调控。大量研究表明，肥胖诱导的2型糖尿病早期即出现胰岛素抵抗伴随胰岛功能障碍，胰岛α、β、δ细胞激素分泌开始紊乱，随着胰岛功能损伤的加剧，患者病情也逐渐恶化。啮齿类动物或人胰岛都存在复杂的空间结构，即使相同类型细胞间也存在异质性，而疾病条件下同种类型细胞亚群如何发生变化并影响胰岛功能的机制并不明确。因此，掌握2型糖尿病早期胰岛α、β、δ细胞亚群的组成变化，并探索可用于区分各亚群的表面标志物，对2型糖尿病的精准治疗和预防具有十分重要的现实意义。

实验方法

采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)方法鉴定hfd诱导的小鼠葡萄糖耐受不良模型中的α、β和δ细胞亚群标记物。采用流式细胞仪和免疫染色对各亚群的比例进行分类和评估。对分选细胞进行单细胞蛋白质组学分析，通过蛋白表达深入阐明各α、β、δ细胞亚群在葡萄糖耐受不良中的功能状态。

研究结果

1. 小鼠胰岛单细胞RNA测序

本研究对5只普通饮食（cd）喂养的小鼠和5只高脂饮食（hfd）喂养的小鼠进行了高通量scRNA-seq分析。研究分析了15093个来自cd喂养小鼠胰岛的细胞和18906个来自hfd喂养小鼠胰岛的细胞，发现其被聚成四种主要内分泌细胞，基于主要激素基因表达进行了注释:4069个α (Gcg)， 14108个β (Ins1)， 1698个δ (Sst)和666个PP (Ppy)细胞。此外，根据先前报道的标记基因，发现了少量内皮细胞、免疫细胞、间充质细胞和导管细胞（图1-d）。接下来对α，β，δ这几种细胞类型进行差异基因和功能富集分析，发现内质网的蛋白质加工在α、β和δ细胞中显著富集（图1e-g）。

2. Ace2在α细胞中的异质表达

为了分析α细胞的异质性，使用scRNA-seq数据将α细胞聚成8个簇（图2a-b），并分析了8个聚类中的marker基因表达（图2c）。本研究发现与严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染相关的关键基因Ace2在α细胞群中显著变化。根据Ace2的表达水平，将8个α细胞簇分为Ace2low(簇3和5)和Ace2high(簇0、1、2、4、6和7)亚群。ScRNA-seq和免疫荧光证实了在cd和hfd小鼠胰岛中α细胞亚群的存在（图f,g,j）。为了探索ace2 α细胞异质性的分子特征，我们在Ace2low和Ace2high亚群之间鉴定出379个差异基因（图2h），并对差异基因进行了KEGG富集分析（图2i），表明Ace2的表达可以区分具有不同功能和生存状态的α细胞。我们还发现，在Ace2low组中，α细胞特异性转录因子（Mafb和Irx1）和α细胞相关基因（Ttr、Chgb、Fev和Pyy）显著下调。相反，Ace2low α细胞开始表达具有β细胞特征的基因（如Ucn3、Ero1lb、和Slc2a2）。其中一些结果通过qPCR（图2m-q）和western印迹（图2k）对分选的α细胞群进行了证实。这表明，Ace2low亚群可能代表了未成熟的α细胞，似乎具有β细胞样特征。

3. 表明α细胞亚群功能的单细胞蛋白质组学

用胰岛单细胞悬液的 FACS将α细胞（胰高血糖素[GCG]+）细胞分为ACE2high组和ACE2low组。值得注意的是，HFD小鼠中ACE2high α细胞的比例（65.3%）明显低于CD小鼠（80.0%）,这表明基于ace2的α细胞异质性可能参与了糖尿病的病理生理过程（图3a,b）。从FACS分选的的CD和HFD小鼠（每个样本2000个细胞）中收集ACE2low和ACE2high α细胞亚群进行单细胞蛋白质组学分析。检测到的蛋白数量在3042~4021之间，重复性良好。PCA也能明显区分ACE2low细胞和ACE2high细胞（图3c）。在CD小鼠中，与ACE2high α细胞相比，ACE2low α细胞中有29个上调，80个DEPs下调(图3d)，受影响的KEGG通路包括Ras信号通路和有丝分裂活化蛋白激酶（MAPK）信号通路（图3 e）。在HFD小鼠中，与ACE2high α细胞相比，ACE2low α细胞中的DEPs明显增加，其中17个上调，301个DEPs下调（图3 f）。KEGG分析发现与营养和能量代谢相关的途径在ACE2低组均显著下调（图3g）。这些发现强烈暗示了ACE2low α细胞的代谢和其他生物活性减弱，特别是在HFD小鼠中。

4. CD81在β细胞中的异质表达

为了分析β细胞的异质性，我们将这些细胞聚为9个簇，并确定了前10个标记基因（图4a-c）。根据最近的一项研究，发现Cd81在细胞簇中有差异表达。研究将9个β细胞簇分为Cd81low（簇0-4和7）和Cd81high（簇5、6和8）亚群（4d-g），发现CD81在CD和HFD小鼠的β细胞中分布的明显异质性，同时也经过了免疫组化的证实（图4j）。接下来分析了Cd81low相对于Cd81 highβ细胞的差异基因和KEGG通路分析，细胞代谢及其相关功能通路以及一系列应激相关和炎症通路被显著富集。而未成熟的细胞标记物（Chga、Chgb、Mafb和Rbp4）在Cd81high亚群中高表达（图4l）。这表明Cd81high亚群可能代表了一组功能较弱和未成熟的细胞。其中一些结果通过qPCR（图4m-p）和westernblot（图4k）对分选的细胞亚群进行证实。

5. β细胞亚群功能的单细胞蛋白质组学鉴定

为了进一步探索HFD对β细胞亚群的影响，FACS显示与CD小鼠相比，HFD小鼠的CD81high细胞比例降低。然后，使用单细胞蛋白质组学（每个样本10000个细胞）分析FACS分选的CD81low和CD81highβ细胞（图5a,b）。PCA显示CD81low和CD81highβ细胞被聚集成两个独立的组（图5c）。比较CD81low和CD81highβ细胞，在CD小鼠中检测到869个上调和373个下调的DEPs，在HFD小鼠中检测到707个上调和312个下调的DEPs（图5d,e）。在CD和HFD小鼠中，与能量代谢相关的途径（包括氧化磷酸化和阿尔茨海默病）在CD81低亚群中被下调（图5f,g），并通过免疫组化和western blot进行了验证。

6. HFD增强了成熟的Slc2a2 low δ细胞的功能

本研究将δ细胞分为 Slc2a2low and Slc2a2high 亚群，通过Slc2a2low 相比于 Slc2a2high差异基因和KEGG功能富集分析显示，上调的通路与钙离子和激素分泌有关，提示Slc2a2low亚组可能功能更成熟（S6a,b）。然而，8周的HFD并没有改变两个delta细胞亚群的比例（图6a,c）。免疫荧光证实了在小鼠和人类胰岛中均存在δ细胞亚群（图6b）。接下来采用FASC对CD和HFD小鼠的Slc2a2low and Slc2a2high  δ细胞亚群（每个样本3000个细胞）进行单细胞蛋白质组学分析。PCA数据显示，Slc2a2low 和Slc2a2high  δ细胞聚集成两个不同的群体（图6d）。Slc2a2low 和 Slc2a2high    δ细胞亚群之间有548个上调和171个下调的DEPs；同时，HFD小鼠中DEPs上调较多（832），下调较少（102）（图6e,f)。KEGG分析显示，与β细胞相似，CD小鼠的Slc2a2low （相对于Slc2a2high  δ细胞）中的氧化磷酸化和阿尔茨海默病通路显著下调(图6g)。在CD和HFD小鼠的Slc2a2low细胞中，多种营养代谢途径也显著上调。综上所述，Slc2a2low δ细胞可能比Slc2a2high δ更具有功能和代谢活性，而HFD进一步刺激Slc2a2low δ细胞的功能和代谢。

总之，我们发现未成熟的胰岛细胞部分失去了它们的身份维持基因，并开始表现出其他内分泌细胞的特征。在HFD诱导的葡萄糖耐受不良中，低容量和未成熟的ACE2low细胞的比例随着功能活性和成熟的CD81low细胞比例的增加而增加。成熟的Slc2a2low δ细胞功能增强，但比例不变。这些动态变化揭示了胰岛对HFD应激反应的代谢可塑性。这种可塑性适应可以通过抑制高血糖来抵消代谢应激，恢复葡萄糖稳态，增强细胞的低血糖作用，并增加δ对α和β细胞的调节。

参考文献：

Fu Q, Jiang H, Qian Y, et al. Single-cell RNA sequencing combined with single-cell proteomics identifies the metabolic adaptation of islet cell subpopulations to high-fat diet in mice[J]. Diabetologia, 2022: 1-17.