百萤 ApoSight绿色胱天蛋白酶3/7底物实验方案

一、百萤 ApoSight绿色胱天蛋白酶3/7底物工作原理

ApoSight 绿色半胱天冬酶3/7底物是个直接检测活细胞中半胱天冬酶活性的荧光探针。它由三个部分组成，包括a）荧光团，b）半胱天冬酶选择性肽片段（DEVD），以及c）细胞穿透部分。细胞穿透部分将探针带入活细胞。进入活细胞后，半胱天冬酶选择性肽片段被半胱天冬酶裂解以释放荧光团。恢复的荧光强度直接与要检测的胱天蛋白酶3/7的活性有关。与活细胞中现有的半胱天冬酶测定相比，ApoSight Green Caspase 3/7底物更加稳定，方便和准确。 ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物释放出Ex / Em〜490/520 nm的荧光团。如NucView试剂所报道的，它不需要DNA相互作用就能发荧光。如FMK肽探针所报道的，它不抑制胱天蛋白酶活性。尽管胱天蛋白酶的荧光FMK肽抑制剂被广泛用于检测活细胞中的胱天蛋白酶活性，但该技术有一些严重的局限性：a）FMK半胱天冬酶抑制剂具有很高的细胞毒性，因为FMK肽与活性胱天蛋白酶共价结合。 b）FMK肽与caspase的不可逆共价结合会抑制caspase活性，导致假阳性凋亡。 C） FMK分析具有极高的背景，并且需要大量洗涤，从而导低的通量。 d）FMK肽在水溶液中不稳定，必须立即使用。 ApoSight Green Caspase 3/7底物可以用96孔或384孔板进行实验，并易于适应自动化。

 二、百萤 ApoSight绿色胱天蛋白酶3/7底物参数

Ex(nm)       500

Em(nm)      522

分 子 量      1290.61

溶      剂      DMSO

存储条件     在-15℃以下保存，避光防潮

三、百萤 ApoSight绿色胱天蛋白酶3/7底物实验方案

简要概述

1.使用96孔板的密度为5×104至2×105细胞/ 100 µL /孔的待测化合物制备细胞
2.加入等体积的ApoSight Caspase 3/7底物工作溶液
3.在5％CO2培养箱中于37°C孵育60分钟
4.用HHBS洗涤细胞1-2次
5.使用带有530/30 nm滤波片（FITC通道）的流式细胞仪或带有FITC滤波片组的荧光显微镜分析细胞

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。

ApoSight Green Caspase 3/7底物储备液（200X）
在ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 µL DMSO，制成200X ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分试样，以避免重复的冻融循环。

2.工作溶液配置

ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液

在ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 µL DMSO，制成200X ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分试样，以避免重复的冻融循环。