外源性H2S促进USP8的硫巯基化以调控db/db小鼠心脏的线粒体自噬

写在前面

        今天推荐的是由哈尔滨医科大学病理生理学系团队在2020年3月9日发表于Aging and Disease（IF：5.401，JCR 2区）的一篇文章，通讯是Weihua Zhang教授，研究表明外源性H2S可以增加USP8的硫巯基化，从而促进线粒体自噬。

研究背景

        大流行病学研究证实，2型糖尿病与心血管死亡率增加有关。在糖尿病中，线粒体是细胞内活性氧(ROS)的主要来源，过量的ROS导致线粒体损伤，从而进一步诱导糖尿病状态下的心肌损伤。生理状态下，细胞通过线粒体自噬清除受损线粒体以防止ROS的累积。

        Parkin是一种RBR型E3泛素连接酶，以自抑制形式定位于细胞质中，其活性对于线粒体自噬至关重要。Parkin可以启动线粒体的蛋白酶体降解，并最终形成自噬。研究表明USP8优先从Parkin中移除K6-泛素链，这是Parkin募集至线粒体所必需的。另外，硫化氢(H2S)是一种重要的气体递质，调节心血管功能。血清中H2S水平降低，可能与糖尿病的进展有关。

摘要部分

        本研究探讨了外源性H2S能否通过促进2型糖尿病心肌细胞的线粒体自噬来保护心肌细胞。作者发现外源性H2S可以改善db/db小鼠的心脏功能，减少线粒体碎片和ROS水平，增强线粒体呼吸链活性，抑制线粒体凋亡。研究发现，在高血糖和高脂状态下，USP8的S-硫巯基化水平在体内外均明显降低，但外源H2S可以逆转这一作用，并促进USP8/parkin的相互作用。进一步研究表明，H2S通过增加USP8的S-硫巯基化促进线粒体自噬的形成，而USP8在线粒体中募集并促进Parkin的去泛素化。

研究内容

1.外源H2S促进高血糖和高血脂下心肌细胞的线粒体自噬     

        作者选择瘦素（leptin）受体缺陷小鼠db/db作为2型糖尿病动物模型，其重现了2型糖尿病的特征。作者发现db/db小鼠心脏的内源性H2S水平降低。作者采用透射电镜(TEM)观察，结果发现外源H2S改善了db/db小鼠心脏中异常的线粒体形态。

        作者还发现db/db小鼠心脏中的自噬小体数量少于对照组和db/db-NaHS组，这揭示外源H2S可能促进自噬而保护心肌。实验表明，db/db心肌组织中p62的表达增加，而外源H2S降低了p62表达，还提高了ATG7、Beclin1和LC3II的表达，这些表达与高血糖高脂的心肌细胞中自噬和溶酶体结合的破坏有关。

        接下来，作者通过MDC染色对自噬进行评估。结果显示，HG+OLE+PAL+NaHS组较HG+OLE+PAL组的自噬水平增加。实验显示，H2S处理组有更多的线粒体形成和更多的受损线粒体与溶酶体融合。此外，高糖、油酸和棕榈酸处理后，心肌中线粒体的LC3B表达降低。

研究结论：外源性H2S促进了高血糖和高脂血症下心肌细胞的线粒体自噬。

2.外源H2S调控线粒体的裂变/融合     

        作者接下来探究外源H2S如何调控线粒体形态。实验表明，与线粒体裂变相关的P-drp1/drp1和Fis1在db/db心肌组织和HG+OLE+PAL状态下明显增加，而NaHS组中这些蛋白表达下调。另外，db/db小鼠和HG+OLE+PAL组的Mfn2表达降低。

        作者发现HG+OLE+PAL组的小线粒体明显增多，且其线粒体膜电位明显改变。实验表明，Mdivi-1、Mito-tempo和外源H2S均增加了Atg7、Beclin1和LC3 II/I的表达，并下调了P62的表达。

研究结论：外源H2S可以保护线粒体的完整形态，使其不受高血糖和高脂血症诱导的线粒体裂变的影响。

3.外源H2S在高血糖和高脂血症下通过向线粒体募集parkin促进线粒体自噬     

        作者发现，H2S处理的db/db小鼠心肌中parkin蛋白在线粒体积累增加。进一步研究表明，高血糖和高脂状态下线粒体中parkin的表达减少，而胞浆中parkin的表达增加。作者还发现db/db小鼠中parkin的胞浆泛素化水平增加。

        实验表明，外源H2S增强了PINK1和Parkin的相互作用，这对于线粒体自噬非常重要。另外，作者发现HG+OLE+PAL组中这两种蛋白的表达均降低。

研究结论：外源H2S在高血糖和高脂状态下招募parkin至线粒体，从而促进线粒体自噬。

4.高血糖高脂的心肌细胞中外源H2S通过USP8的S-硫巯基化调控parkin向线粒体募集     

        实验显示，db/db小鼠心脏中的USP8表达降低。S-硫巯基化是H2S对靶蛋白上特定Cys的一种新的翻译后修饰。研究表明，NaHS处理的db/db小鼠中USP8的硫巯基化水平增加。作者还发现，NaHS处理增加了db/db心肌中USP8/parkin的相互作用。     

        然后作者探讨了外源H2S在新生大鼠心肌细胞中的作用。SSP4是一种多硫化物敏感的荧光探针。实验表明，NaHS增加了SSP4的荧光强度，表明其促进了多硫化物的产生。作者还发现，DTT（逆转硫巯基化的还原剂）的处理可以阻断外源H2S对USP8去泛素化的影响以及USP8与parkin的相互作用。

研究结论：外源性H2S通过S-硫巯基化促进了USP8介导的parkin去泛素化。

5.外源H2S通过激活USP8/parkin信号通路上调线粒体自噬     

        实验表明，在没有USP8的情况下，parkin的泛素化水平明显增加。parkin对Mfn2的泛素化对于调控线粒体自噬有重要作用。作者发现在高血糖和高脂血症下，外源性H2S增加了Mfn2的泛素化水平，而USP8 siRNA处理下则没有增加。     

        实验显示，在USP8 siRNA作用下，parkin在线粒体中的表达减少，而在细胞质中的表达增加。进一步的研究表明，parkin转位到线粒体的增加主要不是parkin表达的增加所致。此外，转染USP8 siRNA的细胞在不同处理条件下线粒体LC3B的表达均降低。

研究结论：USP8介导的parkin去泛素化对线粒体自噬至关重要，它可以改善糖尿性心肌病的线粒体形态。

结论与讨论

        研究表明， H2S可以改善db/db小鼠心脏损伤,并改善高血糖和高脂诱导的新生大鼠心肌细胞的损伤H2S的这种保护作用可能部分归因于S-硫疏基化的修饰激活了USP8，这可能促进了parkin移位到线粒体中，从而促进线粒体自噬。以上研究证据为糖尿病心肌病变中H2S抗氧化作用的机制提供了新的见解。

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原文链接：https://www.aginganddisease.org/EN/10.14336/AD.2019.0524