紧跟国自然热点“自噬”，解密药物作用机制：一篇8+文献的实验设计思路，快来复现吧
研究药物作用机制，可为药物研发提供新的思路和方法。今天小微跟大家分享一篇干湿结合的药物作用机制研究的文章，实验设计思路值得大家参考，一起来看看吧~
研究背景
骨关节炎（OA）是一种常见的慢性疼痛性关节炎，目前尚无根治方法，但药物治疗仍然是主要的治疗手段，因此研究药物的作用机制对临床诊断和治疗非常重要。青蒿素（AT）是一种广为人知的抗疟疾药物，有研究发现，AT可以缓解OA，但具体分子机制不清楚。
技术路线
主要结果
1.AT在IL-1β诱导的软骨细胞中发挥抗炎和软骨保护作用
细胞处理：
将不同浓度的AT（0、2.5、5、10或20 μM）与IL-1β 一起加入软骨细胞中，孵育0、24、48和72 h，以确定AT是否影响正常和OA软骨。
指标检测：
（1）研究AT对OA软骨细胞增殖的影响
结果：CCK8检测发现0-10 μM AT对OA软骨细胞增殖有轻微促进作用，而20 μM AT对OA软骨细胞增殖有显著促进作用。因此，最佳浓度为20 μM （图1A）。
（2）研究AT对IL -1β诱导的软骨细胞的抗炎和软骨保护作用
结果：WB和qPCR检测发现AT以剂量依赖的方式显著抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-a的表达（图1B-C） ；降低软骨基质相关蛋白ADAMTSS、MMP-3和MMP-13的表达（图1D-E）。免疫荧光检测发现AT降低IL -1β诱导的软骨细胞中MMP-3的表达。
2.差异表达基因鉴定及基因集富集分析
RNA测序：
对象：IL-1β组和IL-1β+ AT（20 μM）组软骨细胞
分析指标：
差异表达分析
结果：AT处理后大部分基因下调（图2A-B），最显著下调表达的基因是TNFSF11（图2E）。
（2） GSEA和KEGG分析负调控基因的基因富集分析
结果：对差异倍数至少2倍，p≤0.05的差异表达基因进行分析。结果发现，AT治疗抑制了骨关节炎软骨细胞中的PI3K-AKT-mTOR通路（图2C-D)。
3.TNFSF11在OA中表达上调，在AT治疗后表达下调
细胞分组: Control组、IL-1β组、AT + IL-1β组
指标检测：检测TNFSF11的表达
结果：免疫荧光染色、 qPCR和免疫组化分析结果显示，IL-1β组TNFSF11表达高于对照组，IL-1β + AT组TNFSF11表达明显低于IL-1β组，提示IL-1β诱导的OA中TNFSF11表达上调，而AT治疗后TNFSF11表达下调（图3A-C）。
4.AT可激活IL-1β诱导的软骨细胞线粒体自噬和抑制PI3K/AKT/mTOR通路活化
细胞处理：将不同浓度的AT（5、10或20 μM）与IL-1β 一起孵育软骨细胞。
指标检测：
（1）探究AT在OA软骨细胞自噬激活中的作用
结果：qPCR和WB检测IL-1β诱导的OA中自噬相关基因beclin-1、ATG5、ATG7和LC3显著下调; 免疫荧光染色检测IL-1β诱导的OA中自噬相关基因beclin-1下调。而AT治疗后这些基因上调（图4A-D）。
（2）探究AT 在线粒体中的功能
结果：免疫荧光检测发现，AT以剂量依赖的方式激活线粒体。
（3）探究AT对OA软骨细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响
结果：WB检测发现IL-1β诱导的OA中通路蛋白显著上调，而AT治疗后这些通路蛋白下调（图4F-G）。
5.AT通过下调TNFSF11抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化来激活线粒体自噬，从而缓解软骨退化和缺损
细胞处理：将AT与IL-1β 一起孵育软骨细胞后，进一步联合使用mTOR激活剂MYH1485或者过表达TNFSF11处理。
指标检测：
（1）探究联合使用mTOR激活剂MYH1485或者过表达TNFSF11是否逆转了AT引起的通路抑制和自噬激活。
结果：WB检测发现，联合使用mTOR激活剂MYH1485或过表达TNFSF11逆转了AT对PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达的抑制（图5A-B）和AT引起的自噬激活（自噬相关蛋白表达降低）（图5C-E）。免疫荧光显示过表达TNFSF11逆转了AT对线粒体功能的影响 （图5F）。
（2）探究联合使用mTOR激活剂MYH1485或者过表达TNFSF11是否逆转了AT的抗炎和软骨保护作用。
结果：qPCR显示过表达TNFSF11逆转了AT对炎症因子TNF-a和基质降解相关蛋白MMP3和ADAMTS5的表达的抑制（图5G-H）。
6.AT可减轻OA模型大鼠软骨退化和激活自噬
动物处理：
建立了大鼠OA模型，在OA大鼠和正常大鼠膝关节注射AT，持续4周。
指标检测：
验证AT对OA模型大鼠软骨退化保护和自噬激活的作用
结果：组织学评估：HE和Safranin-O 染色显示，与OA组相比，OA+AT组软骨破坏度降低（图6A-B）。免疫组化显示，与OA组相比，OA+AT组MMP3表达降低，ATG5表达升高（图6C-D），说明AT可减轻OA模型大鼠软骨退化和激活自噬。微计算机断层扫描发现AT治疗减弱了OA（图6E）。
作用机制
在IL-1β诱导的OA中，AT抑制TNFSF11的表达，抑制PI3K-AKTmTOR通路。在没有AT的情况下，TNFSFI1激活PI3K-AKT-mTOR通路，抑制IL-1β诱导的OA自噬。在AT存在的情况下，下调的TNFSF11抑制PI3K-AKT-mTOR通路，促进IL-1 β诱导的OA自噬（图7）
以上就是今天分享的主要内容啦，本研究首先通过整合不同的基因表达数据集或者测序数据和KEGG数据库等工具，预测药物与特定基因或通路的相互作用，然后开展一系列的实验验证药物作用的基因和通路。而且，本研究还结合了线粒体自噬热点进行分析，为文章增色不少。
