「青莲聚焦」磷酸化+乙酰化修饰蛋白质组学揭示番红花在三阴性乳腺癌细胞中的抗癌作用
一些研究表明，番红花提取物及其成分对不同的恶性细胞具有抗肿瘤活性和化学预防作用。然而，番红花诱导的细胞死亡的分子机制尚不明确。磷酸化在大多数细胞过程中起关键作用，如调节细胞周期和基因表达，并调节大多数细胞信号传导途径。此外，赖氨酸乙酰化是另一种 PTM，参与基因转录调控，代谢过程的调节和细胞功能。因此，对这些修饰模式的改变的全面研究将提高对番红花处理诱导MDA-MB-23细胞凋亡的潜在机制的理解。
2022年09月29日，在Journal of Proteome Research (IF 5.37) 杂志上最新发表了题为“Quantitative Phosphoproteomics and Acetylomics of Safranal Anticancer Effects in Triple-Negative Breast Cancer Cells”的研究论文。该研究通过TMT标记方法对番红花处理的MDA-MB-231细胞进行了全面的磷酸化蛋白质组学和乙酰化蛋白质组学分析，揭示了番红花诱导的三阴性乳腺癌细胞凋亡的潜在机制。
研究背景
番红花来自鸢尾科，俗称藏红花，主要在中东和亚洲地区种植，传统上被用作食物的香料和治疗焦虑、抗痉挛、镇静和心血管疾病的草药。藏红花中的生物活性物质主要包括: 藏红花醛、藏红花素、藏花酸和苦番红花素，它们对藏红花的香气、色泽和风味起重要作用。藏红花的香气是由苦番红花素的热分解产生的，具有许多生化特性，如缓解心肌缺血−再灌注损伤，抗结直肠癌细胞增殖活性，诱导肺癌、前列腺癌、和乳腺癌细胞株的凋亡。然而，其作用的潜在分子机制尚不清楚。
研究重点
藏红花醛是藏红花中的一种细胞毒性化合物，可使得三阴性乳腺癌细胞死亡。最近的研究报道了番红花的抗癌作用，进一步证明了它对蛋白质翻译、线粒体功能障碍和DNA片段化的影响。为了更好地了解潜在机制，该研究通过结合TMT标记和富集方法（包括二氧化钛和免疫沉淀）对藏红花处理的MDA-MB-231细胞进行了全面的磷酸化和乙酰化蛋白质组学分析。揭示了不同信号通路中广泛的磷酸蛋白质组调节，这些信号通路被藏红花醛处理破坏。藏红花醛影响DNA复制和修复、翻译和EGFR激活/积聚的蛋白质的磷酸化水平，从而导致细胞凋亡。此外，藏红花醛通过H4的低乙酰化阻止修复，并通过H3的高乙酰化促进促凋亡基因的转录，从而将细胞推向死亡边缘。
样本策略
番红花处理的MDA-MB-231细胞，分别在30min、12h、24h三个不同时间点收集，每个时间点重复三次。此外，以含0.15% 二甲基亚砜的细胞培养基作为对照，两次重复培养12h。
研究思路
研究结果
番红花诱导的MDA-MB-23细胞磷酸化蛋白质组研究进展
共鉴定到4,409个蛋白，14,809个肽以及18,781个磷酸化修饰位点。大多数鉴定的磷酸化修饰发生在丝氨酸（86.5%）上，其次是苏氨酸（13%）和酪氨酸（0.5% ，图1A）。与长期刺激效应相比，在时间点30分钟的番红花刺激时鉴定的磷酸肽远离其他两个时间点分组，最有可能说明对细胞的即时番红花刺激效应（图1B）。使用k-Means将所有磷酸肽聚集在六个不同的簇中，并通过t-SNE进行可视化（图1C）。基于FC＞2倍且 B-H校正p值< 0.05和变异系数(CV%)≤30%的肽被认为是显着差异的磷酸肽。和对照组相比，分别在番红花刺激30min，12和24h后筛选到1,044（812上调和232下调），3,729（2,607上调和1,122下调）和4,844（2,981上调和1,863下调）个磷酸肽。大多数磷酸化位点在番红花处理后上调，表明番红花诱导了大量激酶的产生或抑制了磷酸酶的活性。
番红花通过EGFR信号通路调节细胞分化、增殖和死亡
乳腺癌治疗的主要靶点是表皮生长因子受体（EGFR）和ErbB受体酪氨酸激酶家族的其他相关受体。这些受体调节几个重要生物过程，包括增殖、分化、生存或死亡，特别是在癌细胞中。在EGFR和其他ErbB信号模块的下游有三条重要的信号通路，包括磷脂酰肌醇3激酶/Akt(PKB)通路、Ras/Raf/MEK/ERK1/2通路和磷脂酶C(PLCγ)通路。这些通路在该研究中被发现在番红花处理的30min后受到高度调控。此外，IPA富集分析证明了腹腔注射30min后，erbB信号(3.606 z-score)、乳腺癌HER-2信号(3.13 z-score)、mTOR信号(3 z-score)和表皮生长因子信号(2.111 z-score)均被激活。
作为EGFR激活剂的主要自体磷酸化位点Tyr-1197的磷酸化在番红花处理30min后上调1.5倍，在刺激12h后增加到3.4倍。过度激活的EGFR导致受体进一步内化、积累和细胞凋亡。除了Tyr-1197的磷酸化，在番红花处理后，Tyr-869的磷酸化也被上调。Tyr-869位于催化区，由非受体酪氨酸激酶Src介导。Src对Tyr-869残基的磷酸化是对EGFR刺激的一种促有丝分裂反应，可以导致DNA合成的协同增加。
藏红花处理对MDA-MB-231细胞乙酰化水平的影响
共鉴定和定量了431个蛋白质中的790个乙酰化肽。在处理30min后发现17个(6个上调和11个下调)差异KAc位点，12h后发现132个(123个上调和9个下调)差异KAc位点，24h后发现184个(170个上调和14个下调)差异KAc位点。数据显示，治疗24h后，8种乙酰化蛋白在表达和乙酰化水平上都有显著调节。有5种蛋白在KAc水平中上调，在蛋白表达水平中下调，包括脂肪生成调节因子、端粒酶RNA组分、α-烯醇化酶、磷酸甘油酸激酶、1和果糖二磷酸醛缩酶C。以及3种KAc水平下调，蛋白表达水平上调的蛋白质，包括ADP/ATP转位酶3、ADP/ATP转位酶1、胸腺肽β-4。大多数KAc肽在30min后被发现是低乙酰化的，然而在处理12和24h后被过度磷酸化。进一步研究了与藏红花诱导的赖氨酸乙酰化改变相关的途径，包括氨基酸生物合成，糖酵解/糖异生，剪接体和mRNA剪接，程序性坏死和细胞凋亡（FDR < 0.05）。
组蛋白乙酰化在藏红花处理的MDA-MB-231细胞中的作用
在该研究中，在组蛋白H4、组蛋白H3、组蛋白H1.1和组蛋白H2.B这四个不同的组蛋白中发现了几个受调控的组蛋白乙酰化多肽。通过比较三个时间点之间的组蛋白乙酰化水平，我们发现组蛋白H4上的一些乙酰化位点包括K5、K8、K12和K16残基被番红花处理后下调，而对H4的表达水平没有明显的影响。这4个赖氨酸残基的乙酰化与基因组的编码区高度相关，但与异染色质无关。乙酰化的H4尾巴产生一个开放的染色质来招募负责DNA修复的蛋白质，包括用于DNA修复的ZMYND8和BRD4。因此，H4的低乙酰化导致DNA修复能力下降并诱导基因组不稳定。
另一个受番红花处理影响的核心组蛋白是H2.B，处理24h后K13/16/17/21处的乙酰化水平下调。组蛋白N-末端的赖氨酸乙酰化导致染色质构象的结构变化，这是转录因子与DNA结合以进行基因转录以及DNA修复和重组事件所必需的。因此，这种低乙酰化也可以抑制DNA修复和沉默细胞周期检查点。
还有一个在番红花处理下受调节的组蛋白是H3，在处理12h后，K18/23处的乙酰化水平增加，其中乙酰化的K18与基因激活有关。然而，组蛋白的高乙酰化为转录因子结合创造了一个更宽松的染色质结构，它也可以激活肿瘤抑制基因的表达，抑制癌基因。此外，在包括乳腺癌在内的一些癌症中，H3在赖氨酸18上的去乙酰化是生存不良的迹象。因此它的高乙酰化支持了藏红花醛对癌细胞存活的不良影响。
组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰基转移酶的磷酸化调控
组蛋白乙酰转移酶p300在Ser-1038处的磷酸化水平在处理12h后下调。Ser1038的低磷酸化干扰了染色质的缩合，增加了组蛋白H3的乙酰化。此外，p300作为肿瘤抑制因子，其在Ser-1038处的低磷酸化增加了蛋白质的稳定性，降低了癌细胞的转移活性和增殖。
在处理30min时组蛋白去乙酰化酶HDAC4和HDAC7，它们经历了磷酸化周转增加，在治疗12h后，HDAC4在癌细胞中达到正常水平，但HDAC7的磷酸化持续增加到24h。可以认为，可能是由于DNA的损伤，在处理的前30min，细胞将HDAC4以其磷酸化的形式送到细胞质中，使其更容易修复DNA损伤，但随着时间的推移，HDAC4被去磷酸化并重新定位在细胞核中，从而阻止了DNA修复。核定位的HDAC4减少了乙酰化，这种减少可能会潜在地阻止细胞修复。上述结果表明，处理12h后，番红花通过减少H4上的乙酰化来防止修复，并通过增加H3上的乙酰化来促进促凋亡基因的转录，从而促进细胞凋亡。
该研究基于磷酸化蛋白质组学和乙酰化蛋白质组学分析一起提供了关于番红花抗肿瘤作用的清晰见解。分别鉴定并定量了与细胞周期、DNA复制、RNA转运和剪接体通路相关的4,851个调节性磷酸肽和216个调节性乙酰化蛋白。在处理的早期阶段，番红花可能刺激DNA损伤，并允许细胞通过蛋白质的磷酸化激活DNA复制检查点来修复DNA。在这个阶段，藏红花通过共价阻断 PTP1B磷酸酶抑制EGFR去磷酸化。番红花还通过去磷酸化/磷酸化调节涉及细胞周期、DNA复制过程和蛋白质翻译的关键蛋白质，显著调节DNA复制。研究还发现，组蛋白乙酰化差异包括在表观遗传调控和DNA修复过程中。结果表明，藏红花醛通过促进DNA损伤、抑制DNA修复和抑制蛋白质翻译而诱导细胞凋亡。
磷酸蛋白质组学和乙酰化蛋白质组学揭示番红花在三阴性乳腺癌细胞中的抗癌作用
期刊名称：Journal of Proteome Research
影响因子：5.37
样本选择：番红花处理的MDA-MB-231细胞和对照细胞
技术策略：磷酸蛋白质组学和乙酰化蛋白质组学
