「青莲聚焦」蛋白质组学在阿尔茨海默症(AD)biomarker研究中的应用
继前几期不同蛋白质组学技术在阿尔茨海默症中的应用系列文章分享之后，本期给大家带来蛋白质组学在阿尔茨海默症biomarker研究中的应用案例。下面跟着小编一起来看看吧~
阿尔茨海默症(AD)是一种与衰老相关的神经退行性疾病。据估计，全世界约有5000万人患有阿尔茨海默症和其他类型的痴呆。该病的主要临床表现为严重的认知功能减退、进行性记忆丧失、逆行性和顺行性健忘症，并伴有严重的组织病理学改变，如海马体退化和随后的皮质丧失。广泛的分子研究揭示了这种疾病的病理特征是β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集和tau蛋白过度磷酸化。尽管数十年来进行了积极的研究和药物开发，但尚未完全了解这种脑退化的确切原因。随着蛋白质组学技术的快速发展，已被广泛应用于各种疾病的检验，对于了解AD疾病的复杂调控网络及寻找特异性的biomarker提供了重要帮助。
基于质谱的蛋白质组学分析通常包括三个主要步骤：
(i) 质谱前样品处理；
(ii) 质谱数据采集；
(iii) 质谱后生物信息学分析，每个步骤都提供了多种策略来实现蛋白质鉴定和定量的最终分析目标。
图1. 蛋白质组学研究策略
蛋白质组学图谱揭示AD进展机制
基于AD的蛋白质组学分析数据，作者绘制了一个简单的平衡模型来讨论已识别的DE蛋白在AD发展过程中的作用（图2）。在AD无症状阶段激活的生物学过程和细胞通路中，有些可能发挥保护作用。然而，随着疾病进展过程中有害损伤的加剧，保护作用已经耗尽。由此产生的不平衡导致神经元退化和临床症状的出现。但这些AD相关蛋白的功能很可能在疾病长期发展过程中是多因素的，并且它们是起到保护作用还是有害作用取决于时间、区域和细胞环境。
图2. AD疾病进展过程中有害和保护因素的平衡模型
基于蛋白质组学的AD生物标志物的发现
基于质谱的脑脊液蛋白质组学研究，在发现生物标志物方面取得了令人振奋的进展。在许多蛋白质组学研究中，高丰度蛋白往往会掩盖低丰度蛋白，因此去除高丰度蛋白是提高低丰度蛋白质检测的常用方法。作者整合了6个深层脑脊液蛋白组学的数据集(每个>1,000个蛋白，总计260个AD和对照组)，共获得5939个蛋白数据，其中包括311个上调蛋白和165个下调蛋白（图3），为将来的验证提供了AD脑脊液蛋白质组资源。
与脑脊液分析相比，AD血浆/血清样本的深度MS分析比较有限，由于血脑屏障的原因，大脑中的分子变化可能不容易在血液中检测到。另外由于独特的血液成分（极大的动态范围，例如从白蛋白(~50 mg/ml)到白介素6(~4.2pg/ml)）也给分析带来一定的挑战。因此AD血液样本中低丰度蛋白的检出对于生物标志物的研究具有巨大的应用前景。接下来，介绍两篇血液标志物研究的应用案例
案例一
研究背景
记忆力减退是阿尔茨海默病 (AD) 最常见的临床症状，因此寻找预测认知能力下降的外周生物标志物对于早期诊断AD是很有前途的。由于血小板与神经元生物学有相似之处，它可以作为神经系统疾病生物标志物的外周基质。该研究采用TMT-LC-MS/MS对轻度认知障碍(MCI)、重度认知障碍(AD)和年龄/性别匹配的正常认知对照组(Ctrl)的研究队列进行了全面深入的血小板蛋白质组学分析。系统的阐释了在认知衰退过程中，血小板作为最稳定的外周基质所体现的生物学意义。并结合机器学习，发现了具有AD早期诊断价值的血小板蛋白生物标志物。
样本策略
10例轻度认知障碍（MCI）、9 例重度认知障碍（AD）和 9 例年龄/性别匹配的健康对照组（Ctrl）的血小板样本。
技术策略
TMT蛋白质组学+WB+机器学习
研究思路
通过TMT蛋白质组学共检测到2994种血小板蛋白，与对照组相比，在 MCI 和 AD 患者中共检测到 360 种差异蛋白。这些差异蛋白参与多种 KEGG 途径，包括 AD、AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 途径、端粒酶 RNA 定位、血小板活化和补体活化。通过与MMSE评分的相关性分析，确定了三个正相关通路和两个负相关通路与MCI和AD患者的认知能力下降密切相关。偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 显示 PHB、UQCRH、CD63、GP1BA、FINC、RAP1A、ITPR1/2 和 ADAM10 等 9 种蛋白质的变化可以有效区分认知障碍患者和对照组。进一步的机器学习分析显示，四种减少的血小板蛋白组合，即 PHB、UQCRH、GP1BA 和 FINC，最有希望预测 MCI 和 AD 患者的认知能力下降。总之，该研究提供了一组用于预测认知能力下降的血小板生物标志物，可用于 AD 的早期筛查。
案例二
研究背景
流行病学资料显示2型糖尿病(T2DM)患者的阿尔茨海默症(AD)发病率较高，认为T2DM是AD发展的重要危险因素。因此，识别与轻度认知障碍(MCI)相关的外周生物标志物对AD的早期诊断具有重要意义。该研究针对伴有MCI的T2DM患者(T2DM-MCI)和不伴有MCI的T2DM患者(T2DM-NMCI)进行了血小板蛋白质组学分析。并结合机器学习算法，获得了针对2型糖尿病人群预测认知能力下降的组合生物标志物。
样本策略
组学队列：T2DM-NMCI 10例、T2DM-MCI 9例的血小板样本；
验证队列：T2DM-NMCI 30例、T2DM-MCI 34例的血小板样本。
技术策略
TMT蛋白质组学+ELISA+WB+机器学习
研究思路
共检测到2994个血小板蛋白，其中46个差异表达蛋白(DEP)在T2DM-MCI与T2DM-NMCI之间(p<0.05)。DEPS的复杂网络调控主要涉及内吞作用、过氧化物酶、ErbB、磷脂酰肌醇等信号通路。Pearson分析显示，与有丝分裂/自噬、胰岛素信号转导和糖酵解/糖异生途径相关的蛋白可能是T2DM患者认知能力下降的潜在血小板生物标志物。其中，Aβ1-42/Aβ1-40和rGSK-3β(T/S9)的升高可以区分T2DM-MCI和T2DM-NMCI。机器学习显示，OPTN和rGSK-3β的组合可有效提高MCI的鉴别能力，验证集的ROC分析显示，其AUC 为 0.927，准确度为85.9%，灵敏度为85.3%，特异性为 86.7%。对预测2型糖尿病患者认知能力下降具有较好的应用前景。
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