蛋白质印迹（Western blot）实验知识分享

蛋白质印迹（或免疫印迹）分析程序可从复杂混合物（例如细胞或组织提取物）中鉴定和定量单个蛋白质。 通常，该技术涉及在变性条件下通过凝胶电泳分离蛋白质，从凝胶上将蛋白质电泳转移或“印迹”到固体支持膜，用对目标蛋白质具有特异性的抗体探测该膜，然后观察结合的抗体 使用标记的第二免疫试剂。   因此，蛋白质印迹技术是在不同条件下对健康和疾病中的组织或培养细胞进行蛋白质组学分析的必不可少的检测方法。

W B实验步骤:

  
一、样品的裂解
◇制备出细胞培养物的裂解物
1.将细胞培养皿置于冰上，用低温的PBS对细胞进行洗涤。
2.吸出PBS缓冲液后再加入介于0℃的细胞裂解缓冲液（每107细胞/100mm；培养皿/150cm2 培养瓶中加入1ml；每5×106 细胞/60mm培养皿/75cm2 培养瓶中加入0.5ml）。
3.用预冷后的细胞刮棒将贴壁细胞刮下，然后将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中后；
4.在4℃温度条件下下持续搅拌约30分钟左右；
5.在4℃预冷后的离心机中以16000×g的转速离心大约20分钟左右；
6.小心地将离心管从离心机中取出，防止在冰上，然后将上清液转移到放置冰上的新离心管中后，弃去沉淀。
◇制备组织裂解物
1.在0℃条件下，用干净的工具切取目标组织（注意：该过程需要快速完成），以确保样品不会被蛋白酶降解；
2.将组织置于圆底的微量离心管中，然后浸入液氮中进行速冻，将样品保存在-80℃下以备后续试验继续使用，也可放置冰块上直接进行匀浆。取约5mg的组织，然后向离心管中快速加入约300μL的裂解缓冲液，选用电动匀浆器进行匀浆，另外的300μL裂解缓冲液冲对刀片进行两次清洗，然后在4℃下持续搅拌（一般实验选用回旋振荡器上）2小时。
3.4℃温度条件下，在微型离心机中以16000×g的离心速度离心约20分钟，然后轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰块上。将上清液转移放置在冰上的新离心管中后弃去沉淀物。

二、样品制备
1.取约50μL的裂解物，进行蛋白分析，以确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
2.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2×Laemmli样品缓冲液。一般推荐采用以下方法对样品进行还原和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
3.还原和变性：在100℃温度条件下，将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸5分钟左右，之后进行分装。在-20°C温度下保存裂解物，注意：分装细胞裂解物(50-100μL)，避免反复冻融循环。
4.在37℃温度条件下，对装有细胞裂解为的离心管进行解冻，在微量离心机中以16,000×g的离心率，离心约5分钟。

三、上样和电泳
1.将等量的蛋白质和分子量标准上样到SDS-PAGE凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为20-30μg，纯化蛋白的上样量为10-100ng。
2.在100V下电泳1至2小时。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。应使用还原型凝胶，除非抗体数据表中推荐使用非还原性条件。
凝胶百分比取决于蛋白质的大小：4～40kDa12～45kDa10～70kDa15～100kDa25～200kDa20%15%12.5%10%8%

四、把蛋白质从凝胶转移到膜

       膜可以是硝酸纤维素或PVDF，两者各具优点。用甲醇活化PVDF约1分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液对PVDF进行冲洗。实验过程中需要对时间和电压进行优化（依据设备）。在封闭步骤之前采用丽春红染色法检查转膜，所得膜可用于抗体染色。

五、抗体的染色
1.用5%封闭溶液在室温条件下封闭膜约1小时，或在4℃条件下封闭约24小时；
2.用适当稀释度的一抗在5%或2%封闭溶液中4℃约12小时孵育膜，或在室温条件下孵育约2小时；
3.用TBST洗涤膜3次，每次大约5分钟；
4.用推荐稀释度的标记二抗，在含5%封闭缓冲液的TBST中室温条件下孵育膜1小时；
5.使用TBST缓冲液冲洗膜3次，每次大约5分钟，然后用TBS缓冲液进行冲洗；
6.要产生信号，请遵循试剂盒厂商的实验方法；
7.去除多余的试剂，并采用透明塑料膜覆盖膜；
8.利用暗室显影技术，采集化学发光图像，也可以利用常规图像扫描法采集比色检测的图像。