转录因子与启动子相互作用研究策略

转录因子与基因启动子相互作用的研究属于转录调控方面的研究，也是研究相对集中的基因表达调控方式。转录调控分析不能盲目地为了研究具体机制而做研究，需要与基因功能研究密切联系起来作为前提条件。我们首先要明确感兴趣的转录因子是否会导致靶基因表达水平发生改变，进而引起细胞或动物发生相应的表型或生物学功能改变。当明确这些问题后，拟通过转录调控去深挖其中的具体机制，通常可以采用荧光素酶报告基因分析，包括转录因子与靶基因启动子互作验证、确定转录因子的结合位点以及转录因子相关结构域。

       荧光素酶报告基因分析可以有效地在体外评估转录因子调控启动子的能力。对于转录因子与启动子互作验证，目前普遍采用基于pGL3-basic载体的双荧光素酶报告基因系统。当然，如果目的启动子活性较强，使用pGL3-basic即可；若启动子活性较弱，可以选择带有强启动子的pGL3-enhancer或promoter载体。pGL3-basic系统需要用到三种质粒（图1）：

（1）  pGL3-basic：带有目标启动子序列的报告质粒，萤火虫荧光素酶(fLuc)作为报告基因；

（2）  pRL-TK：内参质粒，海肾荧光素酶(rLuc)作为内参基因，使fLuc的检测均一化；

（3）  pcDNA3.1：转录因子过表达质粒。

图1. pGL3-basic双荧光素酶报告基因系统的三种质粒图谱

构建好以上三种质粒后，共同转染转染至哺乳动物细胞。用于报告基因分析的细胞可以选择具有转染效率高、易培养等优点的工具细胞，如HEK293细胞，这已得到广泛的认可，也是较为常见的做法。当然也可以使用实验所用的目的细胞，或根据个人实际情况选择常见、合适的细胞。

       关于靶基因启动子序列，我们通常选取转录起始位点上游2000bp的区域作为启动子区，再运用预测转录因子与启动子结合的数据库分析二者结合的可能性及潜在结合位点，常用的数据库有JASPAR（推荐）、PROMO等。

       那么转录因子与启动子互作分析一般可以有以下几个方面。首先可以初步明确转录因子对靶基因具有转录激活或转录抑制作用；接着需要明确转录因子的结合位点，就必须构建启动子的截短体或突变体等，分别进行验证双荧光素酶验证分析。一般情况下，转录因子都具有转录激活/抑制结构域和DNA结合结构域，可以针对这两个区域构建转录因子突变体，通过比较野生型和突变型转录因子的调控能力，研究其转录调控能力。

1、  构建全长启动子分析：明确转录因子对靶基因启动子的转录调控作用。

2、  构建启动子截短体分析：将启动子上转录因子的潜在结合位点进行缺失，构建启动子截短体，与全长启动子比较，明确缺失区域是否在转录因子发挥作用的重要位置。

3、  构建启动子点突变分析：通过启动子的截短体我们可以验证转录因子的转录调控作用是否与潜在结合位点相关，随后可以进一步对这些潜在结合位点进行点突变，探讨结合位点碱基突变是否影响转录因子对靶基因的转录调控能力。

4、  构建转录因子突变体分析：另外还可以构建转录因子相关功能域的突变体或截短体，研究转录因子的功能结构域。

另外，实验设计分组也是比较关键的，只是明确转录调控关系一般分四组，进一步研究结合位点则每研究一个位点就增加两组实验。

表1. 常规4组

表2. 常规6组（仅供参考，需根据实际情况设计）

   以上便是研究转录因子与启动子相互作用的常用方法及一般策略，希望对大家的实验设计有所帮助。汉恒生物在双荧光素酶验证上有着成熟的服务体系，欢迎大家咨询！