质粒扩增-包病毒-病毒感染

质粒扩增

试剂准备：

LB培养基：

    胰蛋白胨    10g/L

    酵母提取物 5g/L

    NaCl  10g/L

倒平板需要的琼脂培养基

    胰蛋白胨    16g/L

    酵母提取物 10g/L

    NaCl  5g/L

    琼脂粉 15g/L

配置好后高压蒸汽灭菌，琼脂培养基不烫手时加入氨苄（买来后，将粉末用超纯水配置成100mg/ml，用的时候1：1000加），倒平板，封口膜封好，4°放置备用

第一天：

1. 从-80冰箱取出30ul感受态大肠杆菌（30ul即可，方便后面挑单克隆）置于冰上融化

2. 快速加入1ug（大约2ul）质粒溶液，轻轻摇匀

3. 冰浴30min

4. 置于42℃水浴/金属浴中热激90s（精准把控时间），热激过程不要移动离心管

5. 冰上2min

6. 加入700ul无抗性LB，37℃摇床40-60min

7. 无需离心，轻轻混匀取20ul，加入80ul的LB培养基（剩下的可以放于4°，方便继续涂板）

8. 100ul用于涂板，玻璃珠或者玻璃棒都可以

9. 过夜培养，14-16h，<18h

第二天：

经过第一天的操作将获得单克隆培养皿

1. 准备一个50ml离心管，加入20ml抗性（含有氨苄1：1000）LB培养基

2. 挑菌落（大小适中，3-5个，最好不要挑单菌落，防止有突变），拿枪头戳一下或者划一下菌落，打入50ml管中

3. 稍微拧松瓶盖，并用胶布固定，用完的培养皿可以用封口膜缠好，方便继续摇菌

4. 过夜摇菌（37°摇床），可以根据浑浊情况，离心菌量，适当延长摇菌时间

第三天：

1. 收集菌液，4500rpm离心为提取质粒准备

2. 根据具体试剂盒说明说操作

   我这用的是天根生化(TIANGEN)的无内毒素质粒小提中量试剂盒

   需要注意的地方我框了出来

   
   

包装病毒

原理：

所用细胞类型：293T

试剂准备：HilyMax

操作步骤：

！！！所有混匀都是轻轻的混！

1.293T细胞密度80%左右最为适宜（细胞状态好成功率高），提前将293培养基37℃预热，提前1-4h换液（10cm皿+9ml培养基）；

2.准备一个EP管，加入900ulDMEM；

3.向EP管中加入5ug的PLP1,PLP2,PLP-VSVG，以及目的质粒，轻轻混匀；

4.向EP管中加入40ulHilyMax，轻轻混匀，静置15min；

5.EP管内试剂全部转移至293T细胞培养皿中，此时不要混匀吹打，缓慢摇匀，不要剧烈晃动。

6.6-10h换液（先预热培养基）

7.48h后收病毒，换液（预热），+24h后二次收病毒

8.病毒液吸入15ml离心管，为方便二次收病毒需立即加入新培养基，吸出的病毒液，1500rpm/10min

9.10ml注射器吸取上清，取下针头，插上0.45um过滤器，然后分装到1.5mlEP管中，每管1ml（储存于-80冰箱）。每次取两个加入到小皿中，再加1ml培养基来感染。

或者

打入浓缩管中，4000G/10min，吸取浓缩病毒液转移至1.5mlEP管（400ul），测蛋白浓度，-80储存。

病毒感染

小皿+1ml培养基，2ml病毒液，3ul polybrene，8-12h换液

传到10cm大皿中，待长满后，传代，传两个大皿，同时加入嘌呤霉素或其他抗性的药物筛选

            第一次筛，10ml先加7ul，后面再增加到10ul，筛两次，约一周