文献解读｜鉴别食管鳞状细胞癌的混淆细胞
文章：Identifying a confused cell identity for esophageal squamous cell carcinoma
期刊：Signal Transduct Target Ther， 2022 ，IF 13.493
技术：ScRNA Seq
导语
恶性细胞的细胞特性及其产生是理解癌症的基础。作者研究发现食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞显示出与所有三种正常食管上皮细胞相同但不同的分子特征，作者称之为混淆细胞身份（CCI）。CCI是与ESCC不良预后相关的独立预后标志物。此外，还鉴定出TPM4是促进ESCC体内外侵袭性的关键CCI基因。TPM4通过激活Jak/STAT-SOX2通路来产生CCI。因此，作者研究提示了ESCC细胞的一个未知的特征，这可能对临床预后和潜在干扰有价值。
研究结果
1. 单细胞转录组学揭示CCI是ESCC细胞的独特特征
采用 10× Genomics单细胞测序分析了7例ESCC样本和1例对照正常食管样本。共获得44,206个细胞，鉴定了鳞状上皮细胞、腺上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和其他肿瘤微环境细胞（图1a，b，c）。通过 inferCNV分析，患者的鳞状上皮细胞有明显的拷贝数变化，被鉴定为ESCC细胞。在正常食管组织中，食管鳞状上皮细胞由三种主要类型的细胞组成，包括基底干细胞（BS）、增殖的基层角质细胞（BK）和分化角质细胞（DK）。这些细胞在形态、定位、分化和分子特征彼此不同，BS可以通过逐步分化产生BK和DK。发现正常鳞状上皮细胞可以分为三个连续的亚群。作者的数据集和人类细胞图谱食管数据集中4885个细胞的组合观察到了类似的三个亚群（图1d）。其中BS表达SOX2、TP63和KRT15，BK高表达KRT5，DK表达KRT14、KRT13和IVL这些marker基因。无监督的命运图显示了从BS到BK和DK的伪轨迹（图1d）。
为了可视化ESCC细胞与正常食管鳞状上皮细胞的关系，创建了BS、BK和DK的三元图（图1e）。所有恶性细胞都落在三角形的中心，与每个角落的距离相等。基因表达热图显示ESCC细胞表达BS、BK和DK的所有marker基因，尽管水平略低（图1f）。同时，恶性细胞中检测到的基因平均数量明显多于正常细胞（图1 g）。作者将这种相对于正常细胞的新细胞身份称为混淆细胞身份（CCI）。为了量化三元图上每个单元格的CCI，作者设计了一个CCI分数，通过计算三个角度的余弦值的标准差，以单元格位置的点为顶点，点到每个角的连接线和原点为射线。正常细胞的CCI评分中值为21.2，恶性细胞为43.2（图1h）。作者认为CCI是恶性细胞的一个新的分子特征。
2. CCI是ESCC在多个队列中的特征
分析发现，具有侵袭性进展的ESCC患者的平均CCI评分明显更高（图2a）。在已发表的60名ESCC患者队列中，有16名I期和44名II/III期患者，早期患者的CCI评分显著低于晚期患者（图2b）。在单细胞水平上，CCI评分与ESCC晚期特异性基因的表达显著正相关（图2c）。
在TCGA ESCC的81名患者中，作者发现所有II/III期患者位于CCI图的中心，而I期患者的位置接近DK的角落（图2d）。高级别患者的平均CCI评分显著高于I期患者（22.1对38.7，p = 0.028）（图2e）。同时，CCI评分高的患者预后明显低于CCI评分低的患者（中位生存时间484 vs.1263天，p = 0.02）（图2f）。多个队列数据分析表明，CCI评分可以作为ESCC患者的独立预后指标。
3. CCI的分子机制
通过比较CCI阳性细胞和阴性上皮细胞来鉴定CCI标志基因。195个基因被鉴定为ESCC的CCI标志基因；在CCI图上，CCI标志基因在三个角的正常细胞中不表达，而在中心的恶性细胞中高度表达（图3a）。同时，这些CCI标志基因的表达水平与CCI评分显著正相关（图3b）。
CCI标志基因在ESCC患者中，在蛋白质水平上高度表达的有六个：CBR1、GSTM3、HSPB1、MIF、PGK1和TPM4（图3c）。其中包括原肌球蛋白4（TPM4）在ESCC患者中具有最高的诊断价值，也是ESCC和各种癌症中蛋白质水平上调最多的基因之一，同时TPM4高表达与不良预后显著相关（图3e）。TPM4的表达水平与单细胞水平和患者水平的CCI评分显著正相关（图3f，g）。因此，作者认为TPM4是CCI基因。
4. TPM4过表达增加CCI评分，TPM4促进小鼠ESCC转移
在食管的类器官中过表达TPM4，对类器官的大小没有显著影响。传代以后，类器官产生了更多的次级类器官，表明TPM4促进了祖细胞的自我更新（图3h）。相反，敲除Tpm4显著减少了食管类器官的形成（图3i）。因此，TPM4可能不是细胞增殖或生长所必需的，但对食管上皮类器官的自我更新至关重要。Tpm4过表达类器官的CCI得分显著高于对照器官（图3k）。总之，TPM4促进了食管上皮细胞的CCI。
在小鼠ESCC类器官中过表达Tpm4，将对照和Tpm4过表达的ESCC类器官原位植入受体食管上皮层下。荧光活体成像显示，Tpm4过表达肿瘤的荧光强度显著高于对照肿瘤（图4a，b）。活检显示Tpm4过表达的巨大肿瘤扩散到整个胃，而对照肿瘤仅限于移植部位（图4c）。实验表明Tpm4过表达的肿瘤比对照组更具侵袭性。
有趣的是，作者在Tpm4肿瘤的受体小鼠的多个部位发现了强烈的荧光信号（图4a）。活检显示，Tpm4小鼠在许多器官上显示出特异性的信号通路，包括肝脏、脾脏和淋巴结，这是患者ESCC转移的热点。所有6名Tpm4受体的肝脏和淋巴结均有转移，而六名对照ESCC患者中只有一人在肝脏有转移，而没有一人在其他器官有转移（图4f）。
5. ESCC中CCI的TPM4 Jak/STAT-SOX2轴
将对照和TPM4过表达的食管类器官进行了转录组分析。结果表明，Jak/STAT信号通路是Tpm4上调最多的通路之一（图4g）。IHC染色也证实，与对照肿瘤相比，Tpm4肿瘤的p-Jak2和p-STAT3水平增加（图4h）。而且Tpm4过表达的ESCC类器官对Jak2特异性抑制剂AZ960的敏感性显著高于对照组（图4j）。已报道中Jak/STAT途径可以上调SOX2，SOX2是细胞身份和ESCC进展的关键转录因子。与对照肿瘤相比，Tpm4过表达的ESCC肿瘤类器官的SOX2染色增加（图4k），WB显示过表达TPM4，SOX2表达上调，而敲除TPM4，SOX2表达下调（图4i）。而且加入AZ960降低了体外和体内SOX2水平（图4k）。
最后，作者发现Jak/STAT信号通路基因的表达水平与ESCC中的CCI评分显著正相关（图4l）。重要的是，AZ960对Jak/STAT通路的抑制显著降低了ESCC细胞的CCI分数，并将Tpm4过表达的ESCC细胞从CCI图的中心驱动到DK侧（图4m,n）。
参考文章：
Pan Xiangyu,Wang Jian,Guo Linjie et al. Identifying a confused cell identity for esophageal squamous cell carcinoma.[J] .Signal Transduct Target Ther, 2022, 7: 122.
