细胞生物学实验--小鼠骨髓细胞染色体标本的制备

一，实验目的

了解利用动物骨髓进行细胞染色体制片的一般方法，掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段。观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征。利用显微照相技术对所得切片进行照相。

二、实验原理

染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息。因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标。进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过人工培养的悬浮液。如将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收并可转运到骨髓，结果使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，使得染色体停在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。这种制片方法是属于侵害性的，因此这种方法适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料。对于大型动物可以采取骨髓穿刺术获得红骨髓，在临床上用于一些血液疾病的研究分析。对于一些珍稀的鸟类可采用羽髓来制片，方法基本一样。人类的染色体分析可采用外周血培养的方法来获得大量的细胞材料。

三、 实验用具及材料

实验材料：体重20克左右的小鼠一只

实验试剂：0.075mKCl低渗液、固定液（甲醇：醋酸＝3:1）、0.4%秋水仙素、改良苯酚品红溶液、二甲苯 

实验材料：恒温水浴槽、纱布、烧杯、离心管2支、刀片、镊子、解剖盘、解剖剪、镊子、注射器、离心机、镜头纸

光学显微镜、带数码相机的光学显微镜

四、 实验步骤

腹腔注射秋水仙素溶液：在做实验前2~3小时，对实验用小鼠按0.1ml/20g小鼠的量对其进行0.4％的秋水仙素注射。

取材：实验时，用断颈法迅速将小鼠处死，通过解剖取出股骨，用注射器吸取在37℃下保温的低渗液2毫升，将针头插入骨髓腔中冲洗骨髓，使冲洗液从股骨的另一端流出。收集冲洗液到5ml刻度的离心管中。

低渗：用吸管将冲洗液吹打几次，然后把离心管放在37℃恒温水浴槽内低渗20分钟。

固定：之后取出并加1ml的固定液，吹打之后放入37℃恒温水浴槽内固定10分钟。

离心：然后将1000rpm离心10分钟，弃去上清。

再固定：加入固定液继续固定10分钟（先吹打，再放入恒温水浴槽）。

离心：再1000rpm的速度离心10分钟。弃去上清，

制备细胞悬液：离心结束弃上清，最后留大约与沉淀等量的上清液，

滴冰片：从冰箱里取出预冷的载玻片4块并排，手持吸管在载玻片上方向下滴片。

干燥：让其自然晾干。

染色：用改良苯酚品红溶液染色10分钟左右。

去浮色：清水冲洗，风干。

镜检：先用低倍镜找到一好的分裂相区域，然后转用高倍镜观察。

观察和照相：用油镜观察，并选取良好的视野照相。

结果与讨论

实验讨论

1）影响实验结果的重要步骤：

（1）秋水仙素的注射

     虽然这一步不是我们完成的，但是它对于本次实验至关重要，如果没有秋水仙素使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，使得染色体停在中期状态，因为细胞分裂中期在整个分裂期中占的比例不大，我们就很难得到那么多分裂中期的细胞，也就难以观察。

（2）取骨

      取骨可参照人的大腿骨位置，而不是主观地判断其大小，取骨后一定要把肌肉除净，否则最后的制片效果会受到影响。

（3）低渗

      分析我们装片分散不够好的原因，我认为主要问题就出在低渗上。低渗液可以使细胞充分吸水膨胀而不破裂，从而一直保持在胀得很大而又没有破裂的状态。进而使得细胞内的中期染色体就能够足够分散开来，从而使得经固定等步骤后仍然处于膨胀状态。之后经过滴片时的摔打和骤降温过程，使细胞很快破碎，染色体进一步分散开。如果细胞低渗处理不够，在细胞从高处掉下也无法摔碎，染色体将难以观察。

（4）滴片

      经过实践，我们认为吴老师说得很对，越高越好，在我们可达到高度范围内，基本不用担心染色体摔碎的问题。比较了我们的片子和个子高的同学的片子，我们更加确信了这一结论。（我们都是站着往地上滴片的。）

六、实验小结

这次实验要注意的地方：

处死小鼠的时候要果断。这次实验采用断颈法杀死小鼠，按住头部后要用力拉。出于人道主义和对实验对象的尊重，我们都应该让小鼠在最少的折磨中死去。

取骨后要清理干净。

注射低渗液的时候要注意看，如果液体从针头入口出来，说明另一头没有剪开，应该再剪一次。

低渗液处理时间可以长一点。

第二次加固定液是1ml而不是书上写的5ml，实验结果，加1ml和加5ml区别不大，但从节约的角度，选取1ml。

滴片要高。

找到好的视野后要记住它的位置，方便显微摄像。

七、思考题

1. 显微照相见图一。

2. 统计小鼠2N染色体数目，仔细观察其形态特征。

小鼠体内2n染色体数目为40条，形态上多为中部着丝粒染色体。

3. 低渗液起什么作用，在使用过程中应注意什么问题？

答：低渗液的作用是使细胞充分吸水膨胀而不破裂，从而一直保持在胀得很大而又没有破裂的状态。进而使得细胞内的中期染色体就能够足够分散开来，从而使得经固定等步骤后仍然处于膨胀状态。之后经过滴片时的摔打和骤降温过程，使细胞及其核很快破碎，染色体进一步分散开。在滴片的时候就能够获得一团仅属于一个细胞的分散的中期染色体的片子，易于在显微镜下观察和对染色体进行计数。使用时应该十分注意适当的低渗时间和温度，以及低渗液的浓度。