USP22通过降低mTOR活性在结直肠癌中发挥肿瘤抑制功能

写在前面

        今天推荐的是由德国Göttingen分子生物科学中心在2019年9月2日发表于Cell Death & Differentiation（2020IF：15.828，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Steven A. Johnsen教授，研究表明USP22通过降低mTOR活性在结直肠癌中发挥肿瘤抑制功能。

研究背景

        USP22是SAGA转录辅因子复合物的去泛素化亚基，是基因“癌症死亡”特征的成员。USP22一直被认为是一种有前景的治疗靶点，因为其高水平表达与多种实体瘤（包括结直肠癌CRC）的远处转移、生存率差和高复发率相关。

摘要部分

        作者试图使用具有组织特异性Usp22消融的肠道致癌小鼠模型来研究Usp22在体内肿瘤发生过程中的作用。此外，作者评估了人类CRC细胞中USP22敲低对致瘤潜力的影响，并确定了潜在的分子机制。作者首次报道了USP22在体内具有肿瘤抑制功能。有趣的是，肠道特异性Usp22缺失加剧了由Apc突变引起的肿瘤表型，导致生存率显着降低和肠道肿瘤发病率升高。因此，人类CRC细胞在体外和体内USP22减少后显示出增加的致瘤特性，并诱导与CRC患者不良结果相关的基因表达特征。值得注意的是，USP22丢失导致mTOR活性增加，其致瘤特性是由USP22丢失引起的。在这里，作者证明USP22可以在CRC中发挥肿瘤抑制功能，其中它的缺失通过调节mTOR活性增加CRC负荷。重要的是，作者的数据揭示了USP22的肿瘤和背景特异性作用，表明USP22表达可以作为癌症患者治疗分层的标志物。

研究内容

1.USP22在体内抑制CRC肿瘤发生

        基于Usp22高表达会增加肿瘤负荷的假设，作者检查了组织特异性、条件性Usp22基因缺失在小鼠肠道肿瘤发生模型中的影响。为此，作者在有无杂合Apc1638N截断突变的情况下生成了Usp22缺失的小鼠。单独的Usp22肠道丢失仅略微影响小鼠的总体存活率。令人惊讶的是，在Apc突变的背景下，Usp22缺失显着降低了存活率，其中Apc1638N/+、Usp22fl/fl小鼠在他莫昔芬注射后14-33周死亡，而野生型或Usp22杂合动物的存活时间明显更长。此外，肠道特异性Usp22缺失也与注射他莫昔芬和较短的结肠后体重减轻更多有关。有趣的是，在Apc1638N/+、Usp22fl/fl小鼠中，与同窝小鼠相比，结直肠肿瘤的数量和大小显着增加。USP22在正常、健康的肠上皮和肿瘤的肠上皮中的蛋白质水平以及mRNA水平都明显减少。

研究结论：肠道中Usp22的缺失导致存活率降低并显着增加肿瘤负荷。这些发现揭示了USP22在体内实体瘤中的先前未知的肿瘤抑制功能。

2.肠道内Usp22的缺失会增加体内肿瘤的侵略性生长

        在评估H&E染色的结肠切片时，作者在Usp22fl/fl动物中发现了几个肿瘤区域扩散到结肠内肌层以外，表明Apc突变小鼠中Usp22的缺失不仅增加了结肠中的肿瘤数量和大小，但也促进了肿瘤的侵袭性生长。此外，具有肠道特异性Usp22缺失的小鼠在结肠中显示出上皮损伤。有趣的是，与野生型动物相比，Usp22+/fl和Usp22fl/fl小鼠均显示出较低程度的完整上皮。为了评估Usp22缺失后肿瘤生长增强的潜在机制，作者分别用Ki67和CD31作为增殖和内皮细胞的标记对Apc1638N/+小鼠的结肠切片进行染色。实际上，Usp22fl/fl动物的细胞增殖和血管生成均升高。

研究结论：肠道内在Usp22缺失后，不仅导致肿瘤数量和大小增加，而且肿瘤侵袭性也升高。

3.USP22减少增加了体外人CRC细胞的致瘤潜力

        为了进一步研究CRC细胞中的USP22功能，作者在体外检查了USP22敲低对HCT116细胞中细胞生长特征的影响。作者观察到与对照相比， siUSP22敲低加速了HCT116结肠直肠癌细胞的增殖。此外，在USP22敲低后，迁移特性、细胞生长和克隆形成的潜力都提高了。与作者结果一致，TCGA研究网络生成的人类患者肿瘤基因表达数据分析表明，USP22低表达往往与直肠腺癌预后不良相关。因此，作者试图确定降低的USP22水平如何影响全基因表达和信号通路。为此，作者在对照siRNA转染和USP22敲低的HCT116细胞中进行了mRNA-seq分析。GSEA揭示与CRC患者不利结果相关的基因表达模式高度上调，而在USP22敲低后，与有利结果相关的基因下调。

研究结论：低USP22表达促进了体外CRC细胞的致瘤特性，并影响与患者预后相关的基因表达模式。

4.USP22缺失增强了体外和体内的致瘤潜力

        为了评估CRC细胞中USP22永久缺失的后果，作者利用CRISPR/Cas9技术敲除HCT116细胞中的USP22。虽然敲除USP22不影响细胞形态，但它增强了增殖，类似于siRNA转染。作者接下来通过将这些细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠中来检查USP22缺失对体内肿瘤生长的影响。与体外分析和基因缺失模型一致，USP22敲除加速了该异种移植模型中HCT116肿瘤的生长。与条件性基因缺失研究一致，USP22缺陷型HCT116肿瘤显示血管化增加。

研究结论：CRISPR/Cas9介导的USP22敲除增强了体外和体内CRC细胞的生长。

5.USP22缺乏促进mTOR激活

        作者发现在HCT116细胞中USP22敲除后，几个mTOR信号相关基因受到调节。mTOR通路是一个有吸引力的治疗靶点，因为它影响包括CRC在内的许多人类恶性肿瘤的细胞生长、增殖和存活。作者在HCT116细胞中生成了一系列被mTOR抑制剂雷帕霉素下调的基因并进行了GSEA。该分析表明，在雷帕霉素处理后通常表达降低的基因在USP22敲低细胞中富集，表明USP22表达降低可能促进mTOR通路的活性。由mTOR信号控制并在USP22减少后上调的基因包括白细胞介素20受体亚基β(IL20RB)、磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)和DLG4。事实上，作者使用qRT-PCR验证了USP22敲除增加了这些因子的mRNA表达，并且可以通过用临床批准的mTOR抑制剂（mTORi）依维莫司处理细胞来恢复这种影响。作者接下来试图确定在USP22敲除后激活mTOR通路活性的机制，并确定了PRKAA2基因，编码AMP激活的蛋白激酶α2（AMPKα2），是USP22依赖性的。在Usp22敲除小鼠的肠上皮细胞中证实了Prkaa2的下调。作者认为USP22的缺失可能通过涉及AMPKα2表达降低的机制直接导致mTOR活性增加。因此，作者使用蛋白质印迹检查了mTOR靶核糖体蛋白S6的磷酸化状态，并证实S6磷酸化在USP22缺失后确实增加了。重要的是，这种效果可以通过mTORi依维莫司和雷帕霉素治疗来逆转。事实上，在Usp22缺陷的Apc1638N肿瘤中pS6水平也增加。接下来，作者试图研究去泛素化蛋白USP22的缺乏如何降低PRKAA2 mRNA水平并促进mTOR活性。作者假设这些影响可能与SAGA复合物中USP22的功能有关，并对H3K9ac进行了ChIP，这是由SAGA的GCN5乙酰转移酶亚基介导的。与作者的假设一致，在缺乏USP22的细胞中，PRKAA2上的H3K9ac占有率降低了20倍。此外，GCN5的敲低还导致PRKAA2 mRNA水平降低。

研究结论：USP22缺乏导致GCN5介导的H3K9ac水平降低，从而降低PRKAA2 mRNA表达并提高mTOR活性。

6.USP22缺失使结直肠癌细胞对mTOR抑制剂敏感

        为了评估USP22缺陷肿瘤的靶向性，作者旨在抑制mTOR通路。有趣的是，用依维莫司处理HCT116细胞显着降低了USP22耗尽细胞的增殖，而仅略微影响对照转染细胞。一致地，依维莫司处理也逆转了USP22缺失细胞的克隆形成潜力增加。此外，沉默mTORC1关键成分RPTOR同样降低了USP22敲除细胞的增殖和克隆能力，并逆转了mTORi响应基因的上调。为了证实USP22缺陷肿瘤对mTOR抑制的敏感性，将HCT116 USP22野生型和敲除细胞移植到免疫缺陷小鼠中。用依维莫司或载体溶液治疗动物并每天测量肿瘤大小。与作者之前的观察结果一致，USP22缺失促进了肿瘤生长。然而，这些影响可以通过用依维莫司治疗动物来挽救，其中USP22缺失的肿瘤在依维莫司治疗后显示肿瘤生长减少71%，而USP22野生型细胞仅减少27%。

研究结论：体外和体内USP22缺失后mTOR通路的激活引入了治疗脆弱性，使USP22缺陷的CRC细胞对mTOR抑制特别敏感。

结论与讨论

        总之，作者的结果表明USP22不能严格地被视为致癌基因。事实上，它可以在某些生物学背景下起到肿瘤抑制作用。需要进一步的工作来确定哪些肿瘤类型或亚组将从USP22活性的抑制中增殖最快，在其他情况下，是否可以利用USP22活性降低的个体化治疗方法对mTOR治疗进行患者分类。

Thank you!

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41418-019-0420-8