NBD C6-神经酰胺,高尔基体荧光探针绿色

NBD C6-神经酰胺（NBD C6-Ceramide，高尔基体荧光探针绿色)是一种荧光鞘脂类似物，可渗透细胞膜，是哺乳动物细胞高尔基体、内质网和核膜的重要染色剂。荧光 :λex 467 nm, λem 535 nm in methanol。

溶解度: Solubility DMF: 25 mg/ml DMF:PBS (pH 7.2) (1:1): 500 μg/ml DMSO: 10 mg/ml Ethanol: 5 mg/ml

性状:Solid，power

储藏条件:storage at -4℃ (1-2weeks), longer storage period at -20℃ (1-2years)

实验步骤：

一、制备 NBD C6-Ceramide-BSA 复合物

对于活细胞或固定细胞的染色，使用添加 BSA 的 NBD C6-Ceramide-BSA 复合物能够得到较好的染色效果。NBD C6-Ceramide-BSA 复合物制备方法如下：

1. 以氯仿：乙醇（体积比 19:1）为溶剂配制 1 mM NBD C6-Ceramide 溶液；

2. 吸取 50 µl NBD C6-Ceramide 溶液于小玻璃试管中，保持干燥，通入氮气流，然后在真空状态保持至少 1 小时，以 200 µl 无水乙醇重溶。

3. 量取 10 ml 无血清的平衡盐溶液（如 HBSS 或 HEPES，pH 7.4）到 50 ml 塑料离心管中，加入 3.4 mg（使其浓度为 0.34 mg/ml）的脱脂 BSA。

4. 将含有 10 ml BSA 溶液的试管置于漩涡混合器上混匀，加入 200 µl NBD C6-Ceramide 溶液，漩涡震荡混匀，所得溶液（5 µM NBD C6-Ceramide+5 µMBSA）保存于-20°C。

二、活细胞高尔基复合体染色

1. 用合适的缓冲液（如 HBSS/HEPES）冲洗盖玻片上的细胞；

2. 加入 5 µM NBD C6-Ceramide+5 µM BSA 溶液于 4°C 孵育细胞 30 分钟；

3. 用预冷的新鲜培养基反复冲洗细胞数次，37°C 孵育细胞 30 分钟；

4. 用新鲜培养基冲洗细胞，荧光显微镜镜检。

三、经过固定处理的细胞高尔基复合体染色

注意：染色条件同活细胞样品，但应避免使用含甲醇/丙酮类的固定剂。

1. 用 HBSS/HEPES 缓冲液冲洗盖玻片上的细胞，用 0.5%戊二醛/10%蔗糖/100 mM的 PIPES 缓冲液（pH 7.0）或者 2~4%多聚甲醛（溶于 PBS）溶液室温下固定5~10 分钟；

2. 用预冷的 HBSS/HEPES 反复冲洗细胞数次，加入 5 µM NBD C6-Ceramide+5 µMBSA 溶液于 4°C 冰浴孵育 30 分钟；

3. 用 HBSS/HEPES 冲洗细胞样品，以 10%的 FBS 或者 2 mg/ml 的 BSA 在室温下孵育 30~90 分钟，以加强高尔基体染色效果；

4. 用新鲜的 HBSS/HEPES 将细胞样品冲洗干净，荧光显微镜镜检。