作者︱于美玲

来源︱Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛

一、视频摘要

目前多数实验首先需要进行体外细胞实验来验证其表型与机制，比如真核质粒的共转染来研究两者之间的相互作用与分子机制。因此对于细胞的培养状态、传代与铺板的密度的要求至关重要。而细胞经多次分裂增殖后彼此汇合形成单层细胞,覆盖于培养瓶的底面；随着培养的继续，培养基营养成被消耗，代谢物逐渐增多，为保持细胞的状态，因此需要将培养的细胞按一定比例稀释后(如1:2)转移到新的培养容器中,给予新鲜的培养液继续培养。

二、关键词

Caco-2细胞、细胞传代、铺板

三、试剂、耗材或仪器

试剂：

1．10% DMEM培养基（GOBIO）

2. PBS溶液（Solarbio）

3. PS溶液（Solarbio）

耗材：

1. 15ml 离心管

2. 50ml 离心管

3. 六孔板

4. 细胞培养皿

仪器和软件

低速离心机

生物安全柜

四、实验操作

1. 紫外照射30分钟超净台，并配置10% DMEM培养基（5mL FBS+45mL DMEM），并以1：100的比例加入青链霉素，并在37°C水浴锅预热10min；

2. 取出-80°C冰冻的细胞孵箱融化复苏，加入15mL离心管，并加入1mL 10% DMEM培养基，1000 rpm/min离心3min除去上清液；

3. 离心后，细胞重悬于1mL 10% DMEM培养基中，接种于预先加入7mL的细胞培养皿中，置于37°C、5%CO2 培养箱中培养。

4. 观察细胞生长情况，待细胞生长到90%时，在已杀菌的超净台中吸去之前的培养基，PBS清洗三次；

5. 弃去PBS,加入1mL 0.25%的胰酶（含EDTA）浸润，弃去再加入1mL，置于孵箱消化3min；

6. 3min后加入同等体积的10% DMEM培养基终止消化，将其吸入15mL离心管中，1000 rpm/min离心3min；

7. 3min后加入2mL 10% DMEM培养基重悬，按1:2比例进行传代，分别取1mL接种于预先加入7mL的细胞培养皿中，置于37°C、5%CO2 培养箱中培养。

8. 待细胞生长至90%后，按照实验要求以一定的密度进行铺板，在此过程可以将所需的细胞混匀后，再吸入至每孔中保证细胞均匀铺板。待细胞生长至实验所需要数量后方可进行后续实验。

五、注意事项

1. 在冻存细胞时，要保证细胞慢冻速溶的原则；

2. 为了更好的使细胞均匀铺板，在铺板过程中方可先将所需总细胞数量混合后再进行铺板，保证每孔细胞数相同。

3. 在细胞传代与铺板中，要保证无菌操作，保证细胞传代过程中不被污染；

4. 将细胞传入培养皿后，左右上下各晃动十次后，置于生物安全柜中静止数分钟方可置于孵箱中培养。

Bio-protocol 简介                                 

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