MST免纯化互作亲和力检测二更啦-植物篇

上周我们介绍了MST技术在医学方向免纯化的案例，其实在植物相关研究中同样存在难纯化的问题而且更加复杂，具体表现为：

>大肠杆菌中的异源表达易形成包涵体，难纯化。此外，细菌系统下，蛋白可能错误折叠或者修饰不当导致表达的蛋白功能无效

>目前在真核生物系统中有异源表达的报道，但是诸如在昆虫细胞体系中存在糖基化严重的问题

>蛋白本身不稳定/丰度低/难纯化

>植物研究中构建的GFP融合蛋白在较多情况下纯化困难

面对以上研究难点，接下来跟着小编一起来看下如何利用MST技术实现植物研究中的免纯化亲和力检测！

案例1:植物细胞壁生物合成中糖基转移酶的筛选

鉴定和表征细胞壁生物合成和修饰的糖基转移酶(GTs)是了解细胞壁动力学的基础，然而，常规GTs活性测定方法的通量非常低，且受体通常不可用。

作者优化并验证了MST可以实现GTs底物的高通量筛选：GTs在烟草中表达为YFP-融合蛋白，无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白即可测定底物结合亲和力。将MST方法应用于β-1,4-半乳糖转移酶(AtGALS1)，验证了该技术筛选NDP-糖供体底物和受体底物的能力，该方法将为下一步的研究和工程改造选择候选材料提供极大的便利。

<MST技术应用>

1. MST检测AtGALS1与供体底物的结合

将烟草中瞬时表达YFP-AtGALS1的微粒体作为荧光信号源，加入梯度稀释的供体底物UDP-Gal，检测得到结合亲和力为112±30 μM。大鼠唾液酸转移酶ST-YFP与UGP-Gal作为阴性对照。

2.MST检测AtGALS1与受体底物结合

MST结果显示，在UDP的存在的情况下，AtGALS1可以与聚合度超过3的半乳糖(Gal3)结合，与聚合度超过6的半乳糖(Gal6)受体结合亲和力更高。这一结果与AtGALS1的活性实验结果一致。在没有UDP的情况下，AtGALS1与Gal6不结合。

由于对互作分子的大小没有限制，MST可以用于研究GTs与底物之间的相互作用，且样品消耗量低。在裂解液中进行互作检测克服了植物中天然GTs含量低或外源表达系统中蛋白质修饰不当的障碍，同时不会导致酶活性的丧失。

案例2：植物在高温胁迫下的应答机制研究

研究发现位于叶绿体的热激蛋白21（HSP21）能够保护光系统复合体II (PSII)，使其免受热胁迫或者热胁迫引起的氧化胁迫，但其作用的分子机制尚不清楚。

此外，热胁迫下拟南芥HSP21依赖于GUN5的逆向信号通路激活，并直接结合PSII的核心亚基D1和D2蛋白来稳定光合复合体。组成性表达HSP21可以增强热胁迫下PSII 的热稳定性，修复gun5 突变体的热敏感性，表明HSP21是热胁迫条件下维持类囊体膜系统完整性的关键伴侣蛋白。研究人员借助MST技术直接在接近天然状态下的裂解液中检测了HSP21蛋白与PS II核心亚基D1和D2蛋白之间的亲和力。

<MST技术应用>

植物蛋白尤其是膜蛋白较难纯化或者纯化后活性易受影响无法进行后续实验，利用MST技术，可直接在植物裂解液内进行亲和力检测，无需纯化。

在本次实验中，作者直接使用过表达35S::D1-eYFP或35S::D2-eYFP的转基因植物组织裂解液，向其中加入梯度稀释的纯化HSP21蛋白，检测得到HSP21与D1/D2的亲和力Kd分别为0.67μM和1.32μM。

使用烟草瞬时表达或者构建转基因植物体系，荧光标记蛋白相对容易表达。直接在叶片裂解液中进行互作亲和力检测，无需从细胞裂解液或异源表达系统中纯化目标蛋白，且具有正确的翻译后修饰，快速准确的完成亲和力的检测。