代谢组结合转录组助力解析OCTN2介导的脂质代谢失调在HCC细胞中的作用机制

肿瘤细胞的代谢重编程在肝癌的发展过程中起着至关重要的作用。有机阳离子/肉碱转运蛋白2（OCTN2）是一种钠离子依赖性肉碱转运蛋白和钠离子非依赖性四乙基铵（TEA）转运蛋白，前期研究发现TEA在肾癌和食管癌中促进肿瘤恶化和代谢失调。然而，OCTN2介导的脂质代谢失调在肝细胞癌（HCC）中的作用尚未明确。近日，空军军医大学唐都医院在医学一区TOP期刊《Metabolism-Clinical and Experimental》（IF=9.8/Q1）上发表的题目为“OCTN2 enhances PGC-1α-mediated fatty acid oxidation and OXPHOS to support stemness in hepatocellular carcinoma”的研究论文，通过代谢组和转录组分析了OCTN2介导的HCC恶性肿瘤的机制。

奥维森为此提供了代谢组学检测及分析服务。

研究背景

肝细胞癌（HCC）是一个巨大的公共卫生负担，在世界范围内死亡率较高，尤其是在东亚和东南亚。尽管在HCC诊断和治疗领域取得了相当大的进展，但HCC的发病机制仍然有待阐明。因此，仍然迫切需要探究HCC的分子机制，以探索新的治疗策略。更多的证据支持，在伴有变异恶行表型的肿瘤进展中存在显著的可塑性代谢重编程。此外，根据不同的肿瘤诱导模型，HCC表现出复杂的脂质代谢景观。然而，对HCC细胞中复杂的脂质代谢失调的了解有限，尽管OCTN2在几种癌症进展中的生物学作用已经阐明，但其在HCC恶性肿瘤中的功能和具体机制仍不清楚。

本研究中采用生物信息学分析和免疫组化方法检测OCTN2在HCC组织中的表达。通过K-M生存分析阐明OCTN2表达与预后的相关性。通过WB、细胞球体形成实验、细胞增殖、迁移和侵袭检测OCTN2的表达和功能。通过RNA-seq和代谢组学分析OCTN2介导的HCC恶性肿瘤的机制。

实验设计

实验技术

RNA-seq、LC-MS非靶代谢组、ChIP-seq、qPCR、WB

研究结果

1、OCTN2在体外促进了HCC细胞的增殖、迁移和侵袭

为了阐明OCTN2在细胞增殖中的作用，对HCC细胞进行了几种体外测定。在OCTN2敲低后，通过MTS测定细胞增殖率，SNU-368和HLE细胞中细胞增殖率降低，而Hep3B和SNU-398细胞中的OCTN2过表达加速了细胞增殖（图1A）。集落形成结果显示，与载体组相比，SNU-2和HLE细胞中的OCTN2敲低显著降低集落数，而OCTN2过表达的作用与OCTN2敲低相比显示出完全逆转（图1B）。为了表征OCTN2的致癌机制，通过流式细胞术以研究OCTN2在细胞周期进展和细胞凋亡中的功能作用。发现SNU-2和HLE细胞中ONTN2的下调显著降低了细胞比例，OCTN2上调增加了S期细胞比例（图1C）。细胞凋亡分析显示，HCC细胞中OCTN2的下调增加了细胞凋亡率，而OCTN2的过表达具有相反的作用（图1 D）。综上所述，OCTN2可以通过加速细胞周期进程和减弱细胞凋亡来促进细胞增殖。此外，通过细胞伤口愈合和Transwell基质胶实验，以评估OCTN2对HCC细胞迁移和侵袭的影响。结果表明，OCTN2敲低消除了SNU-368和HLE细胞的转移。相反，OCTN2上调的Hep3B和SNU-398细胞的转移活性高于载体组（图1E-F）。为了进一步评估OCTN2对细胞迁移和侵袭的影响，使用免疫荧光测定和鬼笔环肽染色确定了不同OCTN2表达水平下伪足细胞形成的差异。结果表明，SNU-2和HLE细胞中OCTN2的减少减弱了片状伪足细胞数量，而Hep3B和SNU-398细胞中OCTM2的上调增加了片状伪足细胞数量（图1 G）。

WB检测，以确定与细胞增殖，凋亡，迁移和侵袭相关的几种标记物。G1-S检查点的几个关键调节因子的表达水平在具有OCTN2敲低的HCC细胞中下调，而OCTN2上调具有相反的效果，表明OCTN2在促进细胞周期中的作用（图1H）。

2、OCTN2促进体内HCC细胞生长和转移

通过体内实验进一步了解OCTN2对HCC肿瘤生长和转移的影响。首先，使用具有不同OCTN2表达水平的HCC细胞进行了皮下异种移植肿瘤测定。发现，与载体小鼠相比，SNU-368-shOCTN2组的肿瘤体积和重量减少，而OCTN2过表达显著逆转了这些影响（图2A-D）。组织学检查证实，OCTN2的下调抑制了Ki67阳性细胞率，而OCTN2上调显著导致OCTN2敲低的相反表型，同时OCTN2的IHC染色结果得到了一致的结果（图2E-F）。此外，OCTN2下调后，SNU-2细胞的肺转移数量明显减少。同时，Hep2B细胞中的OCTN2过表达上调了肿瘤转移（图1G-H）。总之，结果表明OCTN2增强了体内HCC肿瘤的生长和转移。

3、OCTN2促进 HCC细胞干性

为了研究OCTN2促肿瘤作用的潜在机制，在TCGA-LIHC数据库中探索了OCTN2相关基因。结果发现，OCTN2高表达的HCC患者中EpCAM和CD24 mRNA水平高表达，它们是HCC癌症干细胞（CSC）中维持干性的表面生物标志物（图3A），此外，与HCC CSC干性维持相关的几种生物标志物的mRNA水平也与OCTN2显著正相关。因此，推测高OCTN2表达是否与HCC CSCs的干性维持有关。采用球体形成实验来测定OCTN2对癌症干性特性的影响。与载体组相比，SNU-368和HLE细胞中的OCTN2敲除显著降低了球体数量，而相对于空载体转染的HCC细胞，OCTN2过表达增加了球体数量（图3B）。之后，对球体进行固定以进行免疫荧光染色，相对于非球体附着的HCC细胞，OCTN2的表达更高，并且与球状HCC细胞中的SALL4表达呈正相关（图3C）。体内稀释的异种移植肿瘤形成测定显示，与对照组相比，具有OCTN2表达敲除的HCC细胞在BALB/c裸鼠中的致瘤能力降低（图3F-H）。以上结果证实，OCTN上调可以增强HCC细胞的干性，维持表型。

4、OCTN2 增强氧化磷酸化 （OXPHOS） 和脂肪酸β氧化 （FAO） 促进 HCC CSC 的干性

为了阐明OCTN2上调如何维持HCC CSC干性，研究中进行了RNA-seq和LC-MS非靶向代谢组测定。对OCTN2敲低的SNU-368细胞与正常OCTN2表达细胞的转录组学KEGG注释分析，揭示了OCTN2与OXPHOS密切相关（图4A）。相应地，Seahorse XFe分析仪的耗氧率（OCR）测定结果显示，OCTN2敲低降低了OCR，OCTN2过表达增加了OCR（图4B-C）。通过转录组的GSEA分析，研究OCTN2是否可以促进HCC细胞的糖酵解，结果表明，OCTN2敲低会减弱糖酵解途径（图5A），而代谢组学结果显示并未影响到糖酵解途径(图5B)。之后进行了细胞外酸化率（ECAR）测定，以研究OCTN2在HCC细胞糖酵解活性中的作用。为了研究OCTN2在促进OXPHOS信号传导中的作用时，HCC细胞如何平衡氧化还原稳态以促进恶性肿瘤，使用shOCTN2 RNA-seq数据进行了与线粒体本身的功能相关的GSEA分析，包括膜电位，线粒体过程，ROS产生和线粒体解毒。细胞对活性氧自由基的反应和活性氧的解毒途径富集。因此，通过检测ROS的总量，线粒体的ROS含量，SOD、CAT和GPX三种主要抗氧化酶的活性，结果显示，OCTN2上调或下调增强或降低了总ROS和线粒体ROS的产生，也增强或减弱了三种抗氧化酶的活性。OCTN2在HCC细胞中的过表达可以增强OXPHOS能力，同时提高SOD、CAT和GPX的活性，以维持线粒体稳态。此外，如图5D所示，基于代谢组学结果对不同肉碱进行聚类分析，结果表明，在SNU-368细胞中敲低OCTN2显著降低了几种肉碱的含量。此外，对HCC细胞中l-肉碱和棕榈酰肉碱含量的定量检测表明，稳定的OCTN2敲低SNU-368细胞和OCTN2过表达Hep3B细胞分别降低或增加了细胞l-肉碱和棕榈酰肉碱含量（图4E-F）。因此，推测OCTN2是否会影响FAO表达。通过OCR测定发现，相对于BSA对照，稳定的OCTN2敲低SNU-368和HLE细胞或OCTN2过表达Hep3B和SNU-398细胞降低或增加了FAO水平（图4G）。此外，还通过BODIPY 493/503染色分析了脂滴含量的变化。结果表明，OCTN2的下调或上调增加或减少HCC细胞中的脂滴含量，表明OCTN2表达可以通过动员脂滴发挥其促进FAO的作用。总之，OCTN2可以共同增强OXPHOS和FAO在HCC细胞中的作用。

为了验证OCTN2是否促进HCC CSC干性，使用埃托莫（一种著名的FAO抑制剂）对稳定的OCTN2过表达Hep3B和SNU-398细胞进行了几项体外测定。依托莫昔显著消除了OCTN2过表达增强的Hep3B和SNU-398细胞的增殖和侵袭（图4H-I）；同时显著减少了OCTN2过表达诱导的HCC细胞球体形成，表明FAO有助于OCTN2过表达介导的HCC CSCs干性维持（图4J）。上述结果证实，OCTN2促进HCC细胞依赖性OXPHOS和FAO信号传导的干性。

5、OCTN2 通过PGC-1α 介导的线粒体生物发生信号传导增强 HCC恶性肿瘤

通过RT-qPCR测定mtDNA含量，MitotrackerGreen染色检测HCC细胞中的线粒体质量，以验证OCTN2可以作为线粒体生物发生的启动子的潜力。结果表明，与SNU-368-shCtrl细胞相比，SNU-368-shOCTN2细胞的线粒体DNA含量和线粒体质量显著降低。同时，OCTN2过表达增加了线粒体DNA含量和线粒体质量（图6A–B）。为了探索TFAM，PGC-1α，c-Myc和PPARγ是否与OCTN2介导的线粒体生物发生和OXPHOS相关，在OCTN2上调或下调的HCC细胞中检测了它们的表达。结果表明，在OCTN2敲低的SNU-368细胞中，PGC-1α的表达在mRNA和蛋白质水平上都显著下调。相反，PGC-1α在OCTN2过表达的Hep3B细胞中显著上调（图6C-D）。此外，PGC-1αmRNA和蛋白质水平的变化在HLE和SNU-398细胞中得到证实（图6D）。Spearman相关分析结果表明OCTN2与PGC-1α表达呈正相关（r = 0.440，p < 0.001）。

此外，还研究了PGC-1α是否有助于OCTN2介导的CSCs维持相关基因的上调。如图6F所示，PGC-1α过表达显著提高了EpCAM、SALL4、CD24、CD133和OCT4的表达，OCTN2敲低下调了这些表达。SNU-2和HLE细胞中PGC-1α上调显著逆转了OCTN368敲低介导的线粒体生物发生，OXPHOS，FAO和球体形成的减少，而shRNA对PGC-1α的衰减减弱了OCTN2过表达介导的线粒体生物发生增加（图6G），FAO和Hep3B和SNU-398细胞中的球体形成（图6H–J）。此外，对经尾静脉注射HCC细胞诱导的异种移植物肿瘤生长和肺转移进行了体内测定，以确定PGC-1α参与OCTN2是否促进HCC生长和转移。结果显示，PGC-1α敲低显著消除了OCTN2过表达诱导的皮下异种移植HCC肿瘤生长和肺转移结节的增强。同时，PGC-1α上调显示出相反的效果（图6K-L）。结果表明，OCTN2通过PGC-1α信号传导增强HCC细胞的恶性肿瘤。

6、米屈肼可在体外和体内抑制HCC细胞恶性肿瘤

Mildronate（米屈肼）是一种选择性OCTN2拮抗剂，用于心脏保护领域。为了验证米屈肼在HCC中可能的治疗效果，我们评估了米屈肼在体外和体内HCC细胞生长和转移中的功能。结果显示，米屈肼治疗显著减少HLE和SNU-368细胞中的HCC集落数量、侵袭细胞数量以及球体形成数（图7A-C）。另一方面，与DMSO治疗组相比，米屈肼治疗显著抑制异种移植肿瘤的体积和重量、减少肺转移病变的数量（图7D-G）。与每种单一药物的效果相比，米屈肼联合索拉非尼治疗可减少肿瘤生长。这些数据表明，米屈肼抑制OCTN2可能是肝细胞癌的前瞻性策略。

研究结论

1、OCTN2在HCC中显著上调，并且与预后不良密切相关。

2、OCTN2上调促进了体外并增加了肝细胞癌的生长和转移。

3、OCTN2通过增加脂肪酸氧化和氧化磷酸化来促进HCC的癌干细胞样特性。

4、PGC-1α信号传导参与了OCTN2过表达介导的HCC癌症干细胞样特性。

5、用OCTN2抑制剂米屈肼治疗显示出对HCC的治疗影响。

参考文献

[1]Yang Tao, Liang Ning, Zhang Jiahao, et al. OCTN2 enhances PGC-1α-mediated fatty acid oxidation and OXPHOS to support stemness in hepatocellular carcinoma[J]. Metabolism, 2023, 147: 155628.