聊聊兰尼碱/ryanodine受体2型（4）：心力衰竭也是“RyR2通道病”？【不正经科普】

温馨提示：本期在写作时默认读者对上期所讲述的内容已有相当的了解。之前已在本系列出现过的术语/缩写将不再展开英文全称（除非我记错它出没出现过了）。

    今天老样子，咱们还聊RyR2，只不过重点跟之前不太一样，从生理学领域转移到了病理生理学范畴。在正式请出主角前，我打算简单介绍一下本期的大魔王：心力衰竭。心衰并不是单独一种疾病，而是由心脏泵血功能障碍导致的综合征。心功能出问题的方式不止一种，可能是收缩没劲，可能是舒张不足，可能二者兼具，甚至还有可能心脏没问题，却碰上了高到过分的代谢需求（即高输出性心力衰竭；由于机制另类，本文接下来不讨论它）。在典型的慢性心衰病程中，机体会想尽一切办法进行代偿，其中有个极为出名的代偿形式叫做心室重构。心室重构包括心室结构、功能以及代谢方式的改变，涉及的尺度大到肉眼可见、小到分子层面，它是病程前期代偿的重要手段，然而也是造成病程后期失代偿的祸患。（押韵了！）我猜不少人一说到心肌重构最先想到的都是较为宏观的东西，而本文的目的之一就是打开一扇通往新世界的大门，带你瞧瞧把心肌推向灾难深渊的那些亚显微乃至分子尺度下的重构过程。RyR2正是这些微观过程中的一位重要人物。

    单个心肌细胞的衰竭很大程度上体现在ECC（兴奋-收缩偶联）的衰竭，后者放大了看最重要的表现之一就是RyR2功能的崩溃。单通道层面上，RyR2最明显的异常举动就是开放概率（Po）升高，自发开放更频繁，跟RyR2对SR内的钙离子过分敏感、容易发生SOICR（钙库超载诱导的钙释放）直接有关。这对收缩和舒张都不好，还易导致心律失常——没错，卒于心衰的患者中相当一部分的死因并非泵衰竭，而是快速性心律失常，主要是室性心动过速（ventricular tachycardia, VT）或心室颤动（ventricular fibrillation, VF）。什么道理呢？首先，异常活跃的RyR2会让更多钙漏出SR（肌质网），钙泵SERCA2a忙不过来，就只能靠质膜上的NCX1（1型钠钙交换体）帮它排钙。长此以往，钙离子外排增多，SR入不敷出，钙储量下降，收缩期能从SR释出的钙量少了，收缩力（以及钙瞬变振幅）自然下降。此外，衰竭心肌中SERCA2a的活性会下调（这也是前面所谓忙不过来的原因之一），由于这个钙泵才是从胞浆回收钙的主力，NCX1不可能完全代偿它的作用，于是舒张期胞质内钙浓度下降速度减缓，导致舒张障碍（以及钙瞬变时程延长）。最后，NCX1的工作模式是一钙换三钠，一排钙就会产生内向电流，还刚好是在膜电位复极化之后。平常这无伤大雅，然而当NCX1干活过于起劲时，这股电流就可能大到激活快钠通道，形成异常的去极化电位。像这样的异常去极化发生在前一次正常去极化之后，因此称为后去极化（afterdepolarization）；而NCX1介导的这种后去极化发生在前一次动作电位完全结束之后，所以叫迟后去极化（delayed afterdepolarization, DAD）。若DAD的幅度够大，就能诱发一个动作电位；若同步产生异常动作电位的心肌够多，就能产生一次异位搏动。由于DAD本质上是它前面那个动作电位中的事件触发的，有它直接参与的致心律失常机制叫做触发活动（triggered activity），是心律失常三大机制之一。就算不能直接诱发异位心律，DAD也可以使不同区域的心肌膜电位不均一，为功能性的折返（re-entry）活动留下隐患，而折返也是前述的三大机制之一。当然，本文的重点并非心律失常的机制，这个话题我会留到下一期再继续讨论。

    最早针对RyR2与心衰关系的研究集中在RyR2的修饰上，其中最经典的是PKA（蛋白激酶A）和CaMKII（钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶）对RyR2的磷酸化，还有不如磷酸化出名但也不可忽视的氧化修饰（比如二硫键介导的亚基间或通道间交联）和S-亚硝基化等等。不过，RyR2修饰异常并不是问题的全部：调控因子本身的失常、二联间隙的重塑，甚至RyR2们在交界区SR空间分布的变化都是ECC衰竭过程中引人注目的事件。本文前半部分集中在对RyR2单通道修饰异常的讨论上，让你领会心衰病程中RyR2与其周围环境的相互作用；后半部分则要谈到更多RyR2之外的事情，从一个RyR2的视角看心衰病程中各种各样的微观重构过程。

    磷酸化的事在上期就出现过了，当时我提了三个磷酸化位点——S2808、S2031和S2814（S是丝氨酸，数字是位号），其中前两个是PKA（蛋白激酶A）的靶标，第三个则是CaMKII（钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶）的靶标。鉴于S2031功能存疑（甚至它的磷酸化跟PKA有无关系都有争议），接下来我们主要的讨论对象将是S2808和S2814。它俩的磷酸化都对RyR2起活化作用，比如让它对胞质钙离子的激活更敏感，以及让FKBP12.6这个RyR2稳定因子更容易从RyR2上解离。RyR2磷酸化水平升高是β受体激活的正常表现，但心衰时持续的儿茶酚胺刺激会让它被过度磷酸化（hyperphosphorylated），使它在舒张期胡乱开放。RyR2过度磷酸化是衰竭心肌中的经典现象，不过合理地解释它并没有这么容易。过度磷酸化的起因无非两方面，一是去磷酸化不足，一是磷酸化过剩。负责去磷酸化的当然就是磷酸酶了，在RyR2超复合体里主要是PP1和PP2A（磷蛋白磷酸酶1和2A）。这两个酶的底物似乎不同：PP1可作用于S2808和S2814，而PP2A可能只作用于S2814。按道理来说，我应该告诉你它们俩的活性在心衰中都是下调的，要不然怎么会去磷酸化不足呢？然而，令人大跌眼镜的是，不少研究提示这两个磷酸酶的活性与表达在心衰时似乎反倒比正常更高！很难说这个现象到底是正常代偿还是调控失衡的结果，说不定事实情况是兼而有之呢。无论是什么原因，磷酸酶的活性太高也不是什么好事，至少有人发现PP1的上调可能会促进心室重构，或许与它去磷酸化PLN（受磷蛋白）从而间接抑制SERCA2a有关。那么问题来了，为什么我们的RyR2会在磷酸酶活性上调的情况下被过度磷酸化呢？这可能是因为衰竭心肌中的PP1和PP2A会离开RyR2超复合体，再强的活性对没法离开SR膜去找它们的RyR2来说也是于事无补；而另一方面，负责磷酸化的PKA和CaMKII不但活性增强，还很喜欢待在RyR2超复合体当中，使无处可逃的RyR2惨遭它们的毒手（误），而它们俩也凭借着这点成为了心衰研究者经常谈起的“罪魁祸首”。我在上期主要提到的是它俩对RyR2门控特性以及CICR（钙诱导钙释放）的影响，当时就强调了它俩的争议很多。本期的重点是它俩在心衰病理生理中的整体作用，在这方面CaMKII的争议远少于PKA，因此我把率先出场的机会给它。

    说实话，PKA对RyR2的激活作用几乎毋庸置疑，而CaMKII对RyR2门控的调节也并非没有争议，可没办法，目前对CaMKII对ECC整体作用的研究结果一致性高得喜人，至少够让被PKA和FKBP12.6搞得头疼的人眼前一亮。CaMKII被胞质中的游离钙激活，底物五花八门且与PKA的底物多有重合，不仅让RyR2嗨起来，还活化SERCA2a，加速胞质钙回收、提高SR钙储量。它平时是提升心肌收缩力和舒缩频率的好帮手，但在病理状态下反而会变成损害心肌功能的催命符。（部分地）通过增强RyR2在舒张期的钙渗漏，它不但促进胞质钙超载诱导的病理性重构，而且还能诱发心律失常。此外，可以想象，RyR2的渗漏可以增加胞质游离钙水平，这反过来又会进一步激活CaMKII，形成恶性循环。抑制心肌CaMKII的活性既能阻碍心衰的进展，又有抗心律失常作用；在抗心律失常方面，它不但抑制室性心律失常，还对心房颤动（atrial fibrillation, AF）有效，因为CaMKII诱导的SR钙渗漏也是AF的推手之一。有趣的是，有研究发现S2814A（CaMKII的磷酸化位点突变成无法磷酸化的丙氨酸）突变的小鼠能抵抗压力超负荷诱导的心衰，却不能抵抗心梗诱发的心衰。或许S2814只在非缺血诱导的心衰中被过度磷酸化，不过谁知道呢。好了，珍惜这段CaMKII的故事吧，因为PKA和FKBP12.6的事可就不清楚多了。拿PKA为例，最早有一份研究显示S2808A突变（跟前面的S2814A同理）小鼠对心梗诱导的心衰抵抗力增强，然而另一份研究发现突变型小鼠不比野生型更能抵抗压力超负荷诱导的心衰。这两份研究用的小鼠品系不同，于是为检验遗传背景的影响，做第二份研究的团队用第一份研究使用的小鼠品系又做了一番实验，结果……跟他们之前的结果一毛一样！受前面关于CaMKII的研究影响，我本来还怀疑可能跟诱发心衰的方法不同有关，然后就发现第三次研究诱发心衰的方法也是人为制造心梗……这一串事儿看得我哭笑不得，也说明了心肌内的事到底有多么复杂。微观层面上，有人观察到PKA对舒张期钙渗漏没什么影响，而CaMKII能增加舒张期钙渗漏；也有人发现S2808磷酸化的缺失对心肌β受体通路的激活没什么影响，尽管还有研究表明儿茶酚胺对S2808A小鼠心脏的正性变时、变力作用都受到了阻碍。（你们打一架吧！）无论如何，尽管PKA对LTCC（L型钙通道）、SERCA2a和RyR2（在单通道层面上）的激活作用争议很小，现有证据还是倾向于认为它不是对心衰“贡献”最大的激酶，真正搞事最多的或许是CaMKII。（但不得不说，不同人对此的看法也不一样。）FKBP12.6也经历了像PKA这样的大起大落：以前它被认为是非常重要的RyR2稳定因子，但现在它的作用正在受到怀疑。对它研究结果的不一致性从上期提到的敲除模型就可见一斑，而这种不一致性也在与磷酸化对FKBP12.6结合状态的影响的研究中体现了出来。举个栗子，有人报道S2808磷酸化并不能影响RyR2对FKBP12.6的亲和力；而说巧不巧，还有一项研究的结果是FKBP12.6会在PKA磷酸化RyR2后解离，却不会在CaMKII磷酸化后解离。抛开这些不谈，FKBP12.6在心肌里的含量实在少得可怜，比它的兄弟FKBP12少了不止一点；虽说它对RyR2亲和力高，但平时多数RyR2其实都找不着FKBP12.6，而是跟亲和力较低但多的FKBP12结合。话虽如此吧，FKBP12对RyR2有怎样的作用也不太清楚……总之，有关于磷酸化的故事就到这里。如果你好奇这一段到底想告诉你个什么玩意儿的话，主要是下面两点：第一，CaMKII磷酸化很可能对心衰病程的演进具有重要作用，PKA磷酸化则有争议；第二，内钙调控真的太他喵的复杂了！（误）

    修饰RyR2的手段除众所周知的磷酸化外，还有没那么有名但很常见的氧化和S-亚硝基化（S-nitrosylation），其中前者指的主要是半胱氨酸残基的氧化。半胱氨酸的氧化比较好理解，就是把两个半胱氨酸连在一起形成二硫键，形成肽链内或肽链间的交联。诱导RyR2氧化的主要是活性氧等强氧化剂。活性氧总被当做坏蛋看待，不过说句公道话，它们其实也是重要的信号分子，可以（小心翼翼地）被用于调控，但也的确容易出问题。RyR2一个亚基就有21个保留有自由巯基可供氧化的半胱氨酸，总数相当多，难怪它对氧还状态十分敏感。一对半胱氨酸被氧化时，它们架起的二硫桥既可能位于一条肽链中间，也可能把一个通道的两个亚基甚至两个通道交联起来。我不太清楚不同的交联方式会不会有不同的后果，但我敢肯定被过度氧化的RyR2不会太舒服。氧化损伤相对轻时，RyR2的SOICR阈值（诱发SOICR所需的SR内游离钙水平）下降，相当于更容易在舒张期自发开放；而当氧化损伤很严重时，RyR2就想不开了（物理），SOICR阈值大大提高以至几乎不可诱发，且这一抑制作用难以被还原剂逆转。虽说RyR2氧化修饰的后果理论上是剂量依赖的，但氧化应激对心肌内钙稳态的主要影响是显著增加SR钙渗漏，个中原因除了RyR2本身活性异常增高外，还跟钙调蛋白（CaM）对RyR2的亲和力下降有关。我们上期说过，CaM是个非常重要的RyR2稳定因子，它的异常解离会导致什么自然不必多言。在更为间接的层面上，除了钙离子外，CaMKII还会被氧化修饰激活，进而磷酸化包括RyR2在内的一系列蛋白，可能也对RyR2的渗漏起作用。不过这就有点超出本段讨论范围了。另一种修饰S-亚硝基化同样也发生在半胱氨酸上，说白了就是往巯基上加一个亚硝基。蛋白的亚硝基化在胞内大都是酶催化的，具体机制与泛素化有点神似，其水平（毫不意外地）受亚硝基供体一氧化氮（NO）含量的影响，顺理成章地也受一氧化氮合酶（NO synthase, NOS）活性的影响。心肌中的NOS有NOS1和NOS3两种，RyR2的亚硝基化似乎主要受NOS1的调控。我猜RyR2的亚硝基化位点是相对特异的（并不确定；如果是特异的，我也不知道具体的位点在哪），而另一方面，至少有些情况下，比如心肌在经历氧化应激（心衰时常有此等情况）时，RyR2的氧化估计就没那么特异了。或许某个本该被亚硝基化的半胱氨酸会先被氧化，结果负责亚硝基化的酶只能对着二硫键干瞪眼。有研究发现心衰时RyR2的S-亚硝基化下调而氧化上调，抑制黄嘌呤氧化酶（会产生活性氧）可以逆转亚硝基化的降低，还能减轻SR钙渗漏、改善内钙稳态、提升收缩力。看起来，一定水平的亚硝基化似乎对RyR2的正常功能十分重要，而降低亚硝基化水平也可能是氧化应激损害ECC的一种较为间接的方式。

    说到这里，本文计划中的前半部分已经结束。我接下来要做的是拓宽眼界，开始更多地关注RyR2之外的东西，也就是“以RyR2的视角看微观重构”。拓宽眼界的第一步可以从观察RyR2身边小蛋白们的变化（激酶的激活就不算了）开始。其实我已经提到不少有关这些小蛋白的事了，FKBP12.6（存疑）和CaM的解离就是个例子。PP1和PP2A两个磷酸酶也有离开RyR2超复合体的迹象。有报道说RyR2自己的表达会下调，考虑到交界区SR蛋白间的奇妙关系，如果我告诉你三联蛋白、交界蛋白和HRC（富含组氨酸的钙结合蛋白）的表达在衰竭心肌里也都下跌的话，你或许不会吃惊。Casq2（集钙蛋白2）的表达量无论是mRNA还是蛋白都不怎么降，但它的糖基化会出问题：甘露糖含量异常偏高。甘露糖苷酶对Casq2身上糖链的裁剪对它定位在交界区SR很必要，未经这道加工的Casq2会滞留在粗面内质网，这辈子没法再靠近交界区SR半步。有趣的是，滞留的Casq2会促进附近区域SOICR的发生，就是说它们能增强细胞核周围（心肌粗面内质网分布在核周）的自发钙释放，可以说是对内钙稳态的二重打击了。除这些离RyR2比较近的东西外，离RyR2稍远点但在功能上算它同事的LTCC、SERCA2a、钠钾泵和NCX1也值得注意。LTCC的表现很有意思，它的门控特征发生了改变——激活电压向超极化方向移动（算是种“获得功能”的变化），激活态开放概率显著上升，同时通道密度（注意不是电流密度）下调，表现出质变量变刚好相反的神奇行为。此外，更有趣的是，LTCC的亚型表达也出现了变化。心脏的LTCC主要有Cav 1.2和Cav 1.3两个亚型，前者分布广泛，在心室表达水平最高，后者的表达则局限于窦房结、心房肌和房室结，以及胎儿和新生儿的心室肌中。衰竭心室肌中Cav 1.3的表达显著上调，伴随着的是Cav 1.2表达的显著下调。说不定前者的上调跟对后者下调的代偿有关。对心室肌来说，Cav 1.3是一个正常来讲只会在胚胎期以及新生儿中出现的“幼稚型”蛋白，因此它的重新表达可以说是个“表型幼稚化”的例子。这类例子在心衰中屡见不鲜，我就不多讨论了。我不打算这会儿就谈这一系列变化对RyR2的影响，因为还有更有意思的跟LTCC有关的事在后面，到时候再一起说更加合适。现在我要先讲一个关于RyR2、SERCA2a、NCX1和钠钾泵的故事，它很精彩地展现了心衰病程中钙稳态相关蛋白们行为变化的特点：彼此影响，互为因果。

    除线粒体里的东西外，心室肌直接调控舒张期内钙动态的转运蛋白主要有两对：一对是控制钙出入SR的SERCA2a和RyR2，一对是调节钙跨质膜流通的NCX1和钠钾泵。（不考虑舒张期LTCC异常开放的影响。）之所以突然把钠钾泵叫出来，一是因为NCX1的排钙模式高度依赖于钠钾泵产生的胞质局部低钠浓度，二是因为在著名结构蛋白锚蛋白B（ankyrin-B）的介导下，有些NCX1与部分钠钾泵共定位于T管，构成一个功能单位。心衰中，SERCA2a活性的下调很普遍，原因比较复杂，跟蛋白表达下降、PP1活性过剩甚至心肌代谢障碍（供能不够）都有关系。引发的后果我在前面已经描述过了，简单说来主要就是SR钙储量降低和胞质钙回收障碍。其他三位也没闲着：NCX1的活性逐渐升高，RyR2的表达和分布（见后）慢慢发生变化，钠钾泵的含量则随着心衰加重而渐渐下滑。要注意的是，这所有变化都是缓慢而循序渐进的过程，因此早期心衰和晚期心衰中这些蛋白的状态连带着心肌的某些状态是非常不同的，而我想说明的正是这些差异。心衰早期，SERCA2a的下调幅度尚小，RyR2刚开始明显泄漏，此时SR钙储量略有下降，但还足以维持正常的钙瞬变振幅。不过，对胞质钙的回收已经受到了SERCA2a下调的影响，于是舒张期胞质钙浓度升高。这不但能激活NCX1，而且也可以通过直接与间接（借助CaMKII的激活）两种方式活化SERCA2a。但它们代偿能力有限，再说舒张期从SR漏出的钙还挺多，因此舒张期间心肌张力上升（因为胞质钙多），且舒张速度变慢（因为回收钙慢）。随着病程进展，SR里面的钙越漏越少，SERCA2a状况的恶化也加剧了这一过程。由于SR里钙真不多了，钙渗漏也在一定程度上受到了抑制。此时，NCX1的状态却与萎靡的SERCA2a完全不同，毕竟它得扛起回收胞质钙的重担（尽管也促进了SR储量下降）。这一系列缘由使舒张期胞质钙浓度下降，舒张期心肌张力甚至能恢复到还算正常的水平。不过有趣的是，舒张速度并不会变快。个中原因不好解释，或许是因为舒张期胞质钙浓度的降低削弱了对SERCA2a和NCX1活性的刺激，结果回收钙的速度下降；但由于SR泄漏减轻，钙浓度还是能降得下来的。当然了，以上所有说法都只在静息条件下成立：β受体通路上调时，SERCA2a的活化令SR钙储量有所提升，尽管可能连正常心肌的静息SR储量都达不到，却已经足以明显加重RyR2介导的舒张期钙泄漏（因为它们的SOICR阈值低于正常），看看上面那张图B栏最右一列那让人不忍直视的异常钙波就明白了。

    至此，我们好像已经把几乎所有能谈到的都谈了一遍。我们的目光最开始集中在单个RyR2的修饰上，然后转移到RyR2超复合体的组分，再到离RyR2较远但功能紧密相关的转运蛋白，能跟一只小小RyR2通道扯上关系的好像也就这么多东西了吧？……总感觉好像少了点什么。回忆一下：上一期的最后，在讨论三联蛋白敲除的影响时，我们见到了一副新面孔——亲交界蛋白（JPH），当时见到的是JPH1和JPH2这两型。心肌中的JPH主要是JPH2，对它的研究也较多，往后我就只说JPH2了。这位仁兄不是转运蛋白也不是RyR2超复合体的正经成员，但考虑到它的重要性以及与另一个有趣话题的相关性，可不能把它给忘了。JPH2是SR上的跨膜蛋白，C端位于SR腔内，长长的N端与T管膜非共价结合，将SR与T管膜联系在一起，维持着二联管紧凑而规整的结构。除此之外，JPH2也算是“半个”RyR2超复合体成员，经常与RyR2互作，像CaM一样稳定它的关闭状态；而它另一头也与LTCC直接互作，似乎能将LTCC招募至特定的区域内，使它们聚集在RyR2对侧，对它们与RyR2们的协作至关重要。说到这里，你说不定已经猜出来我前面说的“另一个有趣话题”是什么了：心肌结构的重构，只不过这个“结构”的尺度是亚显微级甚至分子级的！心衰时JPH2会被明显地下调，刚好上期描述过的三联蛋白敲除模型中也存在它的下调，你不妨联系着上期想象一下衰竭心肌的亚显微结构会如何变化。（当然，并不是所有亚显微结构的变化都单纯是JPH2的问题引起的。）我要首先讲述的结构变化的尺度比亚显微级更小，涉及到一个新的概念：钙释放单位（calcium release unit, CRU）。

    话说RyR2们在交界区SR的分布并不是完全均匀或随机无章的，在正常情况下，它们倾向于聚集起来，形成外表不甚规则的群体，在DNA-PAINT的“镜头”下看起来有如万家灯火，颇为壮观。RyR2团簇的大小（定义为一个团簇包含通道的个数）大致呈指数分布：成员一只手数得过来的小团簇很多，二三十个成员的大团簇较少，平均每个团簇含8.81±3.56个RyR2通道。（BTW，由于是指数分布，这个看起来不大的平均数并不能很好地反映成像研究给人的印象：一眼过去你看到的基本都是些大团簇，放大看才会发现有很多小的。）有趣的是，JPH2具有与RyR2共成簇的趋势，在中到大型团簇中尤其明显（原因之一可能是如果太小的话就很难定义共成簇了）。无论如何，确凿的证据表明，RyR2团簇的大小对其内通道的活性具有显著影响。可以想象，一群RyR2彼此接近，通过影响胞质/SR内局部钙浓度或直接相互作用等方式互相调节，彼此的门控偶联在一起，完全有可能形成一个钙释放的功能单位。也正是由于这些相互作用，一簇RyR2的开放具有类似于协同效应的特征，具体表现为随着胞质游离钙水平增加，团簇中RyR2的Po会呈现出一种仿若相变的变化：相比于独立的RyR2而言，单个团簇成员的Po需要更高的钙水平才会开始上升，但上升得更猛、曲线更陡，整体上就使团簇成员的开闭更加同步，有种“全或无”的感觉。当然喽，CRU并不严格等于RyR2团簇：后者是物理上的结构，前者则是以功能定义的。好了，概念澄清完毕，该说正事了。有好些研究在携有RyR2突变和衰竭的心肌中观察到了一种名为“CRU破碎”的现象，就是说原本一群组成CRU的RyR2分裂成了若干小群，使得通道的整体密度下降。它可能使RyR2间的功能偶联减弱，从而导致包括钙瞬变上升速度下降（开放不同步）、舒张期钙渗漏（关闭不同步）等不妙的后果。CRU破碎的诱因并不清楚；有研究表明JPH2可以促进RyR2聚集成簇，各种心脏病中JPH2表达的下调或许跟它有关，也有人猜想或许它是CRU无法及时适应其他亚细胞尺度重构过程的表现。

    不得不说，CRU破碎是否在人类心脏病中体现仍有争议，但另一种尺度稍大的结构重塑——T管与二联间隙的丢失——在心衰中的存在几乎是板上钉钉的事实。T管以及T管与交界区SR间联系的丢失可以说是衰竭心肌最具标志性的特征之一，其发生发展除了跟CRU破碎似的可能与JPH2的丢失相关外，还跟一个叫做桥接整合蛋白1（bridging integrator 1, BIN1）的小蛋白有些关系。这个蛋白其实在本系列第2期已经悄悄出现了（就在那张展示T管超微结构的图里），它位于T管膜胞质侧，对二联间隙微环境的形成极为重要，使LTCC定位到二联间隙并且成簇和将RyR2招募到二联间隙这两件事都是它参与介导的。有证据表明它在心衰中也会下调，其直接结果之一自然就是LTCC和RyR2找不着彼此。这显然不是什么好事，除了影响ECC效率外，还会通过增加解偶联的RyR2破坏内钙稳态。事实上，正常心肌中也有相当一部分RyR2没有与LTCC相对，但部分因为它们不容易直接观测到，人们对它们的行为和作用了解甚少，也不清楚心衰病程中这部分RyR2的整体变化。很有可能衰竭心肌中解偶联RyR2除在数量上有所增加之外，在分布与行为方面也会与正常心肌中的解偶联RyR2有所不同。可不要小看了这部分神秘的RyR2，好些心肌生理的难解之谜可能都跟它们的行为有着关系，比如所谓的钙渗漏反常：为什么静息的衰竭心肌舒张期自发钙火花频率不见多高（甚至比SR钙储量相同的正常心肌低），SR在舒张期漏出来的钙却一点没少（甚至比正常心肌多）？其实，即使是在正常心肌中，也约有50%舒张期从SR漏出的钙无法用钙火花解释：它们就那么悄无声息地流入胞质，似乎没有几个RyR2注意到它们，尽管它们的量可谓相当惊人。研究表明，这部分不以钙火花形式漏出SR的钙所途经的可能就是那些不与LTCC偶联的RyR2，尤其是这部分RyR2中那些不怎么成簇的、真正“离群”（rogue）的RyR2。这些RyR2既得不到来自LTCC的信号，又缺乏和同族之间的联系，结果它们比在交界区抱团的RyR2更容易开放（见前文关于RyR2团簇成员间协同效应的解释），却又不容易激活一大群RyR2并触发钙火花，在其他RyR2的视线之外不声不响地开开闭闭，形成了相对均一的SR背景钙渗漏。心衰时解偶联的RyR2增多，搞不好这部分背景钙渗漏也会增强，成为活活榨干SR的幕后推手。除了使钙库耗竭之外，持续、大量的钙渗漏也会促进钙诱导的心肌重构，可能与衰竭心脏的一些结构变化（比如肥大及心室扩张）相关，这部分内容会在后面简单提到，运气好的话下一期可能就会出现。

    好啦，一口气说到这里，本文的第二部分也接近尾声了。实话实说，本文的写作历程相当艰难（抛开中间忙了很长时间导致完全没进度不谈），主要是因为我在写这篇之前对心衰的病理生理真的不算非常了解，只是考虑到人们在介绍病理现象时似乎喜欢从获得性的东西开始，再加上我想通过逼自己一把（？）来学点新东西，就一咬牙撸起袖子开干了。此时的我除了为本文即将完结而长舒一口气之外，整个人的状态还不由自主地雀跃了起来；至于这是为什么，那当然是因为——下一期可算要讲到我最感兴趣的东西啦！也许很多人对RyR2感兴趣是因为它在心衰中的作用，但当年让我真正爱上RyR2的是一种遗传性的心电离子通道病，不用说你就能猜到RyR2就是那个在它的情境下出问题的通道。在某些方面，比如说致心律失常的机制方面，它与心衰颇有些相似之处，以至于对它的研究为心衰治疗手段提供了新的思路与妙招。我暂且不提这种疾病的全名（尽管本系列第一期的参考列表里已经提到了），但如果你本来就对RyR2感兴趣或是有好好查过关于它的资料的话，我几乎可以肯定你对它有所耳闻。好了，闲话少说，我们下一期再见！

    本文后半部分提到了CRU这个概念，不难看出这个概念相当基础而重要，以至于我在本系列第4篇才提到它似乎有点晚。之所以这么晚，是因为这玩意尽管十分基础，却一直没有一个统一的定义，直接导致不同文献中的CRU说的不见得是一个东西，搞得最开始想去确认一下CRU的定义的我一脸懵逼，不敢用了。后来我在读一篇综述（下方列表里有）时发现了一个还算清晰的定义，这才有胆把CRU写进本系列里。温馨提醒，如果你在查阅资料时看到了CRU这个词，请务必仔细检查原文，确认作者指的到底是什么东西……

参考文献/拓展阅读：

Blayney, LM., and Lai, FA. Ryanodine receptor-mediated arrhythmias and sudden cardiac death. Pharmacol Ther 123(2), 151-177 (2009). DOI: 10.1016/j.pharmthera.2009.03.006

备注：一篇年代早了点但相当全面的综述，因其全面性享有本系列置顶待遇，读过本系列前几篇的读者对它肯定不会陌生。

Dobrev, D., and Wehrens, XHT. Role of RyR2 Phosphorylation in Heart Failure and Arrhythmias: Controversies Around Ryanodine Receptor Phosphorylation in Cardiac Disease. Circ Res 114(8), 1311-1319 (2014). DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.114.300568

备注：封面与本文第一幅图的出处。

Eisner, D., Caldwell, J., and Trafford, A. Sarcoplasmic Reticulum Ca-ATPase and Heart Failure 20 Years Later. Circ Res 113(8), 958-961 (2013). DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.113.302187

备注：关于心衰中SERCA下调的事。这篇文章标题中暗指的那篇（相对于2013年而言的）20年前的经典文献指的是一篇1994年的论文，它是最早的关于心衰中SERCA表达变化的研究。

Liu, MB., de Lange, E., Garfinkel, A., Weiss, JN., and Qu, Z. Delayed afterdepolarizations generate both triggers and a vulnerable substrate promoting reentry in cardiac tissue. Heart Rhythm 12(10), 2115-2124 (2015). DOI: 10.1016/j.hrthm.2015.06.019

备注：关于DAD与心律失常。本文的主题当然不是致心律失常机制，但这么有趣的话题没有拓展阅读材料实在可惜了。刚好也能为下一期做些准备不是？

Belevych, AE., Radwański, PB., Carnes, CA., and Györke, S. ‘Ryanopathy’: causes and manifestations of RyR2 dysfunction in heart failure. Cardiovasc Res 98(2), 240-247 (2013). DOI: 10.1093/cvr/cvt024

备注：《ECC的辛酸史》（误）那张图的出处。顺带说一句，我很喜欢标题里ryanopathy这个词（可以翻译为RyR通道病），本文标题的灵感正是部分地来源于此。

Terentyev, D., and Hamilton, S. Regulation of Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ Release by Serine-Threonine Phosphatases in the Heart. J Mol Cell Cardiol 101, 156-164 (2016). DOI: 10.1016/j.yjmcc.2016.08.020

备注：关于PP1和PP2A的事。说实话，我在写本文之前都不知道它们的活性在心衰中居然（可能）是上调的，真是孤陋寡闻了……

Champion, HC. Targeting Protein Phosphatase 1 in Heart Failure. Circ Res 96(7), 708-710 (2005). DOI: 10.1161/01.RES.0000164359.95588.25

备注：关于抑制PP1能够缓解衰竭心肌病理表型一事的编辑评论。

Respress, JL., van Oort, RJ., Li, N., Rolim, N., Dixit, SS., deAlmeida, A., Voigt, N., Lawrence, WS., Skapura, DG., Skårdal, K., Wisløff, U., Wieland, T., Ai, X., Pogwizd, SM., Dobrev, D., and Wehrens, XHT. Role of RyR2 phosphorylation at S2814 during heart failure progression. Circ Res 110(11), 1474-1483 (2012). DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.112.268094

备注：S2814在不同心衰情境下不同作用的研究。

Gonano, LA., and Jones, PP. FK506-binding proteins 12 and 12.6 (FKBPs) as regulators of cardiac Ryanodine Receptors: Insights from new functional and structural knowledge. Channels 11(5), 415-425 (2017). DOI: 10.1080/19336950.2017.1344799

备注：关于PKA的那跟掐架似的三项研究以及后面一部分关于FKBP12.6的事出自此文。另外，关于这些激酶的一部分研究结果出自列表第一篇文章，各位感兴趣的可以自行寻找。

Alvarado, FJ., Chen, X., and Valdivia, HH. Ablation of the cardiac ryanodine receptor phospho-site Ser2808 does not alter the adrenergic response or the progression to heart failure in mice. Elimination of the genetic background as critical variable. J Mol Cell Cardiol 103, 40-47 (2017). DOI: 10.1016/j.yjmcc.2017.01.001

Shan, J., Kushnir, A., Betzenhauser, MJ., Reiken, S., Li, J., Lehnart, SE., Lindegger, N., Mongillo, M., Mohler, PJ., and Marks, AR. Phosphorylation of the ryanodine receptor mediates the cardiac fight or flight response in mice. J Clin Invest 120(12), 4388-4398 (2010). DOI: 10.1172/JCI32726

备注：关于S2808磷酸化的两篇再次可以掐一架的结论完全相反的研究……不愧是PKA

Xiao, B., Sutherland, C., Walsh, MP., and Chen, SRW. Protein Kinase A Phosphorylation at Serine-2808 of the Cardiac Ca2+-Release Channel (Ryanodine Receptor) Does Not Dissociate 12.6-kDa FK506-Binding Protein (FKBP12.6). Circ Res 94(4), 487-495 (2004). DOI: 10.1161/01.RES.0000115945.89741.22

备注：关于S2808磷酸化似乎不能引发FKBP12.6解离的研究。另一项观察到PKA对S2808的磷酸化使FKBP12.6解离、却没有观察到CaMKII磷酸化使FKBP12.6解离的研究出自参考列表里的第一篇。又双叒叕可以打一架了

Nikolaienko, R., Bovo, E., and Zima, AV. Redox Dependent Modifications of Ryanodine Receptor: Basic Mechanisms and Implications in Heart Diseases. Front Physiol 9, 1775 (2018). DOI: 10.3389/fphys.2018.01775

备注：关于RyR2氧化修饰的综述，感兴趣者可以一读。其中包括CaMKII被氧化修饰后活性增强的事儿。

Nikolaienko, R., Bovo, E., Rebbeck, RT., Kahn, D., Thomas, DD., Cornea, RL., and Zima, AV. The functional significance of redox-mediated intersubunit cross-linking in regulation of human type 2 ryanodine receptor. Redox Biol 37, 101729 (2020). DOI: 10.1016/j.redox.2020.101729

备注：单个RyR2亚基间交联的研究，专门提到了通道之内、亚基之间的交联会引发CaM的解离。此外，这项研究还发现主要介导RyR1亚基间交联的那个半胱氨酸（的RyR2对应物）在RyR2体内就不是亚基间交联的主要介导者了，所以似乎氧化损伤/修饰还是有点特异性的……

Waddell, HMM., Zhang, JZ., Hoeksema, KJ., McLachlan, JJ., McLay, JC., and Jones, PP. Oxidation of RyR2 Has a Biphasic Effect on the Threshold for Store Overload-Induced Calcium Release. Biophys J 110(11), 2386-2396 (2016). DOI: 10.1016/j.bpj.2016.04.036

备注：关于氧化损伤对SOICR阈值的双向作用。

Gonzalez, DR., Beigi, F., Treuer, AV., and Hare, JM. Deficient ryanodine receptor S-nitrosylation increases sarcoplasmic reticulum calcium leak and arrhythmogenesis in cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 104(51), 20612-20617 (2007). DOI: 10.1073/pnas.0706796104

备注：较早的对RyR2 S-亚硝基化缺乏和异常钙释放之间关系的研究，其中揭示了NOS1和NOS3对RyR2亚硝基化的不同作用，当然还有亚硝基化缺失对RyR2功能的损伤。

Gonzalez, DR., Treuer, AV., Castellanos, J., Dulce, RA., and Hare, JM. Impaired S-Nitrosylation of the Ryanodine Receptor Caused by Xanthine Oxidase Activity Contributes to Calcium Leak in Heart Failure. J Biol Chem 285(37), 28938–28945 (2010). DOI: 10.1074/jbc.M110.154948

备注：关于衰竭心肌中RyR2亚硝基化与氧化的关系，以及黄嘌呤氧化酶在其中作用的研究。

Gergs, U., Berndt, T., Buskase, J., Jones, LR., Kirchhefer, U., Müller, FU., Schlüter, KD., Schmitz, W., and Neumann, J. On the role of junctin in cardiac Ca2+ handling, contractility, and heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293(1), H728-734 (2007). DOI: 10.1152/ajpheart.01187.2006

备注：关于三联蛋白与交界蛋白表达下调的研究。有趣的是，这项研究还发现过表达交界蛋白会损害心肌功能，据此猜想交界蛋白表达的下调可能是一种代偿机制。（BTW，RyR2表达下调的事儿参考自本列表第一篇。）

Arvanitis, DA., Vafiadaki, E., Sanoudou, D., and Kranias, EG. Histidine-rich calcium binding protein: The new regulator of sarcoplasmic reticulum calcium cycling. J Mol Cell Cardiol 50, 43-49 (2011). DOI: 10.1016/j.yjmcc.2010.08.021

备注：HRC在心衰中下调一事的出处。这篇文章也包含很多其他有关于HRC的内容，考虑到HRC不算是本系列的重点，感兴趣的读者不妨看看。

Sibbles, ET., Waddell, HMM., Mereacre, V., Jones, PP., Munro, ML. The function and regulation of calsequestrin-2: implications in calcium-mediated arrhythmias. Biophys Rev 14, 329-352 (2022). DOI: 10.1007/s12551-021-00914-6

备注：有关Casq2在心衰中变化的出处。尽管Casq2会是本系列的重点，但我毕竟不可能比专业综述讲得全面，因此还是推荐读一读的。刚好下期Casq2会经常出现，当做预习或复习也不错！（误）

Chen, X., Piacentino, V. 3rd, Furukawa, S., Goldman, B., Margulies, KB., and Houser, SR. L-Type Ca2+ Channel Density and Regulation Are Altered in Failing Human Ventricular Myocytes and Recover After Support With Mechanical Assist Devices. Circ Res 91(6), 517-524 (2002). DOI: 10.1161/01.res.0000033988.13062.7c

备注：LTCC门控特征与通道密度变化的出处。

Srivastava, U., Jennings-Charles, R., Qu, YS., Sossalla, S., Chahine, M., and Boutjdir, M. Novel re-expression of L-type calcium channel Cav 1.3 in left ventricles of failing human heart. Heart Rhythm 17(7), 1193-1197 (2020). DOI: 10.1016/j.hrthm.2020.02.025

备注：“幼稚型”钙通道Cav 1.3在衰竭心肌中再次表达的出处。

Louch, WE., Stokke, MK., Sjaastad, I., Christensen, G., and Sejersted, OM. No rest for the weary: diastolic calcium homeostasis in the normal and failing myocardium. Physiology (Bethesda) 27(5), 308-323 (2012). DOI: 10.1152/physiol.00021.2012

备注：《两个泵、一个交换体和一个通道的故事》SERCA2a-RyR2系统与NCX1-NKA系统之间那个故事以及配图的出处。不得不说，我被这篇文章讲的东西迷住了，这才会在本文当中插进了这么一个故事。

Lehnart, SE., and Wehrens, XMT. The role of junctophilin proteins in cellular function. Physiol Rev 102(3), 1211-1261 (2022). DOI: 10.1152/physrev.00024.2021

备注：JPH2对RyR2作用的出处（不包括成像研究结果的那部分）。可不要小看结构蛋白！

Jayasinghe, I., Clowsley, AH., Lin, R., Lutz, T., Harrison, C., Green, E., Baddeley, D., Di Michele, L., and Soeller, C. True Molecular Scale Visualization of Variable Clustering Properties of Ryanodine Receptors. Cell Rep 22(2), 557-567 (2018). DOI: 10.1016/j.celrep.2017.12.045

备注：RyR2成像研究相关数据以及那张总结图的出处。

Salvage, SC., Huang, CLH., Fraser, JA., and Dulhunty, AF. How does flecainide impact RyR2 channel function? J Gen Physiol 154(9), e202213089 (2022). DOI: 10.1085/jgp.202213089

备注：成簇RyR2类似协同作用的表现的出处。顺带说一句，这篇文章真正的内容比标题给人的印象丰富且细致得多，全文围绕着“氟卡尼对RyR2的药理作用究竟是怎样的”展开，可谓是一趟精彩纷呈的思维奇旅，尽管因涉及了很多下期内容而有剧透嫌疑，但还是非常推荐感兴趣的读者找个空闲时间认真读一读。

Fowler, ED., and Zissimopoulos, S. Molecular, Subcellular, and Arrhythmogenic Mechanisms in Genetic RyR2 Disease. Biomolecules 12(8), 1030 (2022). DOI: 10.3390/biom12081030

备注：CRU破碎现象的出处，同时也是本文所采用的CRU的定义的来源。

Hong, T., and Shaw, RM. Cardiac T-Tubule Microanatomy and Function. Physiol Rev 97, 227-252 (2017). DOI: 10.1152/physrev.00037.2015

备注：T管结构变化以及BIN1蛋白相关信息的出处，也就是本系列第2期当中那篇令我大开眼界的参考文献。

Sobie, EA., Guatimosim, S., Gómez-Viquez, L., Song, LS., Hartmann, H., Jafri, MS., and Lederer, WJ. The Ca2+ leak paradox and rogue ryanodine receptors: SR Ca2+ efflux theory and practice. Prog Biophys Mol Biol 90(1-3), 172-185 (2006). DOI: 10.1016/j.pbiomolbio.2005.06.010

备注：介绍“钙渗漏反常”并考察离群RyR2在此现象中的可能作用的一篇模拟研究。

Santiago, DJ., Curran, JW., Bers, DM., Lederer, WJ., Stern, MD., Ríos, E., and Shannon, TR. Ca Sparks Do Not Explain all Ryanodine Receptor-Mediated SR Ca Leak in Mouse Ventricular Myocytes. Biophys J 98(10), 2111-2120 (2010). DOI: 10.1016/j.bpj.2010.01.042

备注：关于“非钙火花”的钙渗漏的研究——这篇研究发现钙火花只能解释约50%的SR钙渗漏！