动物实验AAV感染指南——神经系统篇
上期我们介绍了感染肺部的常见注射方法，本期主要介绍感染神经系统的常用注射方法。文字描述末尾有附上视频教程链接哦，小伙伴可直接将网址复制到浏览器中观看学习~
脑立体定位注射操作步骤[1]：
1、用70%酒精棉擦拭脑定位仪，将定位仪的保暖托盘加热后放回，注射器吸取病毒液，随后固定在定位仪上；
2、麻醉小鼠，剃除小鼠头部眼睛到耳朵之间的毛发，用棉球棒蘸取碘伏进行消毒，将小鼠放到立体定位仪的保暖托盘上；
3、定位仪归零牙齿和耳朵的标尺，将小鼠上门牙固定到固定板的槽内，确保头部保持固定；
4、调节bregma（前囟）和lambda（人字缝尖）在同一矢状线上和水平面，务必确保小鼠鼻子居中、稳定；
5、在小鼠的眼睛上涂上眼药膏，防止眼干；
6、用手术刀划开小鼠头部皮肤，刮掉表面硬脑膜，并用夹子固定脑部皮肤；
注：如有血迹请用棉签擦干，确保bregma和lambda位置清晰可见；
7、把bregma坐标归位0（X, Y, Z=0），确保lambda位置与bregma位于同一水平面，根据目的脑区设定好坐标，一旦坐标固定，用马克笔在颅骨做出标记；
8、在10 s内在颅骨钻出一个月0.015 mm的孔，钻的过程务必小心，以防损伤脑组织；
9、根据设好的坐标进针，进针完成后以0.05-0.1μL/min的速度缓缓注射病毒液，通常一只小鼠的注射体积在0.05-2μL之间；
10、注射完毕，保持10min，然后缓慢回针，操作过程中如有血流出需要用棉签及时吸干；
11、缝合伤口，如有必要可注射止疼药；
12、将小鼠放回笼中，使小鼠身体足够温暖，以利于苏醒。
视频教程：https://mp.weixin.qq.com/s/W7EK62Wq4bMilxnUdypy3g
鞘内注射操作步骤[2]：
1、麻醉小鼠，在小鼠的眼睛上涂上眼药膏，防止眼干；
2、靠近小鼠的尾部根部约2 cm2处的皮肤去毛，以便观察下针部位，用蘸取70%酒精的纱布进行消毒；
3、将小鼠放到一个特殊的架子上，在小鼠下用一根15 cm离心管垫起，从而使下针部位稍微拱起；
4、hamilton注射器配30G针头，吸入病毒液；
5、定位脊椎的L6（最突出的一个），并用个手指轻轻按压使之平缓；
6、小心将针头插入L5椎骨和L6椎骨的凹槽之间并注意小鼠尾部会微微上翘，着标志针头成功插入髓鞘；
7、一旦成功插入，用手指固定针头，缓慢注射5-10μL病毒液；
注：注射体积要适当，太小会加大实验误差，体积太大会增加鞘内压力。
8、将小鼠放回笼中，使小鼠身体足够温暖，以利于苏醒。
视频教程：https://mp.weixin.qq.com/s/BqRiMzMpQXcEtiMPHeFV0g
颞静脉注射操作步骤（适用于新生小鼠）[3]：
1、将出生0.5天的新生小鼠放在冰上麻醉30-60s，注意控制时间，不要麻醉过头，容易导致小鼠死亡；
2、将麻醉好的小鼠放置到解剖镜下，一只手控制小鼠，另一只手注射；
3、用食指和大拇指轻抚耳朵位置前后，轻轻拉动小鼠皮肤，当皮肤拉伸的时候颞静脉会看得足够清晰；
注：颞静脉会表现出阴影，而且超背腹运行，并进入颈静脉。
4、如果插入位置适当会看到针尖的斜口处有血液溢出，缓缓将25-50μL病毒液注入，注入病毒液后血管会变白；
5、注射完成后保持针在血管内多留10-15s防止回流，然后拔掉针头，用手轻轻用力按压片刻；
6、将小鼠放回笼中，使小鼠身体足够温暖，以利于苏醒。
视频教程：https://mp.weixin.qq.com/s/XN40iNPaGdlAWxEY3ByzcQ
眼眶后静脉注射[4]：
1、麻醉小鼠，握住小鼠背部，将拇指放在气管正侧面，头部皮毛拢至手掌，使小鼠眼球凸起。
2、将手腕支撑在稳定的表面上，握住注射器，将食指放在柱塞上方。
3、对小鼠施加轻微压力使眼睛凸出，针头对准内眦，斜面朝外，将针头以45°插入眶后窦中心约5mm；
4、使用0.5ml 28G注射器缓慢注入150-200μL（新生小鼠病毒液用量约50μL）病毒液；
5、缓慢地取出针头，确保针头不会划伤眼角膜。使用无菌纱布止血，并在眼睛上涂抹药膏助其恢复。
6、将小鼠放回笼中，使小鼠身体足够温暖，以利于苏醒。
小伙伴可根据实验对象和目的选择合适的注射方式，表1列出了不同注射方式对应的作用区域和病毒用量供小伙伴们参考。AAV2和AAV9是感染脑部的常用血清型，但由于血脑屏障的存在，使用尾静脉注射感染效果不佳。为此汉恒生物研发出了可穿过血脑屏障的血清型AAV-BBB、AAV-cap-B10以及可特异性感染脑部血管内皮细胞的血清型AAV-brl、AAV-BI30。另外汉恒生物还可提供多种特异性启动子（见表2）以感染目的细胞。更多关于神经系统感染的问题欢迎咨询汉恒生物！
表1 不同注射方式的作用区域和参考剂量
表2 神经系统特异性启动子
参考文献：
[1] Benskey M J , Manfredsson F P .Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling[J].Springer New York, 2016.
[2]Junko Y,A E L,C M N, et al. A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model.[J]. Journal of visualized experiments : JoVE,2020(165).
[3]Gombash Lampe, Sara E., Kaspar, Brian K., Foust, Kevin D.. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of visualized experiments : JoVE, 2014, (93):e52037.
[4]Gessler, Dominic J., Gessler, Dominic J., Gessler, Dominic J., Tai, Phillip W L., Tai, Phillip W L.. Intravenous Infusion of AAV for Widespread Gene Delivery to the Nervous System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2019, 1950:143-163.
