泛素特异性蛋白酶7维持DNA损伤反应并促进宫颈癌的发生

写在前面

        今天推荐的是由天津医科大学生物化学与分子生物学系在2018年7月24日发表于Journal of Clinical Investigation（IF：12.466，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Lei Shi教授，研究表明泛素特异性蛋白酶7（USP7）维持DNA损伤反应并促进宫颈癌的发生。

研究背景

        DNA双链断裂（DSB）的识别、信号传递和修复的核心是MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物和DNA损伤检查点蛋白1（MDC1）的介体，它们的相互作用对DNA损伤反应（DDR）的启动和放大至关重要。调控这一分子机制功能的内在规则仍有待研究。

摘要部分

        泛素特异性蛋白酶USP7与MRN-MDC1复合物有物理联系，MRN-MDC1复合物作为USP7的平台，有效地去泛素化和稳定MDC1，从而维持了DDR。因此，USP7的耗尽损害了MRN-MDC1复合物的参与以及随之而来的下游因子p53结合蛋白1（53BP1）和乳腺癌蛋白1（BRCA1）在DNA病变处的招募。值得注意的是，USP7在宫颈癌中过度表达，其表达水平与MDC1的表达水平和宫颈癌患者的生存率呈正相关。作者证明，USP7介导的MDC1稳定化促进了宫颈癌细胞的存活，并赋予细胞对遗传毒性损伤的抵抗力。总之，作者的研究揭示了USP7在调控MRN-MDC1复合物功能方面的作用。

研究内容

1.USP7与MRN-MDC1复合物有直接的物理联系     

        作者首先使用亲和纯化和质谱法来探究MRE11、NBS1和MDC1在体内的相互作用。有趣的是，结果表明，泛素特异性蛋白酶USP7和其他蛋白一样，与MRN-MDC1复合物的这3个成分中的每一个都有效地共存。     

        为了进一步验证USP7和MRN-MDC1复合物之间的体内相互作用，作者使用Superose 6柱和尺寸排除法，通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行蛋白质分馏实验。结果表明，来自HeLa细胞的原生USP7的表观分子质量远远大于单体蛋白的表观分子质量，作者在第17至21馏分中检测到USP7与MRN-MDC1复合物共存的一个大分子质量峰。随后通过点突蛋白或者标记蛋白进行IP实验等，从不同角度证明了USP7和MRN-MDC1复合物之间的相互作用。

研究结论：USP7通过不同的分子表面与MRN-MDC1复合物直接互动。

2.USP7以MRN-MDC1依赖的方式被招募到损伤部位     

        USP7与MRN-MDC1复合物的物理联系意味着USP7在细胞对DNA损伤的反应中的作用。为了验证这一点，作者首先调查了USP7是否被招募到DSB上，通过在不同刺激下对共聚焦显微镜和活细胞成像分析显示，结果表明，USP7在DNA损伤后被动员并被招募到DSB位点。    

        为了研究USP7是否通过与MRN-MDC1复合物的联系参与DSB，用对照的siRNA或针对MRE11、RAD50、NBS1或MDC1的siRNA转染了HeLa细胞。显微镜分析显示，在缺乏MRN-MDC1复合体各组成部分的细胞中，DNA损伤诱导的USP7的招募严重受损，而USP7的表达基本上没有变化，表明USP7是以MRN-MDC1复合体依赖的方式被招募到DNA损伤部位。

研究结论：USP7对DNA损伤的招募是通过其与MRN-MDC1复合物的相互作用发生的。

3.USP7在功能上与MDC1的稳定性有关     

        为了探索USP7和MRN-MDC1复合物的物理相互作用和空间共定位的功能意义，作者首先检查了USP7对MRN-MDC1复合物成分表达的影响。Western blot分析表明，敲除USP7导致MDC1蛋白水平明显下降，同时，MDC1 mRNA的表达没有受到影响。不仅如此，作者发现USP7的敲除与MDC1半衰期的降低有关。此外，作者发现，与USP7敲除相关的MDC1蛋白水平的降低可能是蛋白酶体介导的蛋白降解的结果，因为这种影响可以被蛋白酶体特异性抑制剂MG132有效阻断。     

        另一方面，敲除NBS1不仅损害了USP7与MDC1的结合，而且还导致MDC1蛋白水平的明显下降，这表明MRNMDC1复合物的完整性是USP7促进MDC1稳定的必要条件并且这种下降可以通过回补全长的USP7恢复，而MATH结构域删除（USP7/ΔMATH）的USP7则没有回补效果。

研究结论：USP7与MRN复合物，特别是与NBS1的联系在功能上与控制MDC1的稳定性有关。

4.USP7使MDC1去泛素化     

        为了确定USP7促进的MDC1稳定是否依赖于USP7的酶活性，作者建立了多西环素诱导（Dox-inducible）表达WT USP7（USP7/ WT）和USP7的催化无活性突变体（USP7/C223S）的HeLa。Western Blot分析表明，在USP7敲除的条件下，MDC1的下调可以通过强制表达USP7/WT得到恢复。     

        作者接下来探究USP7是否具有使MDC1去泛素化的功能。实验发现，敲除USP7或使用USP7的抑制剂导致泛素化的MDC1水平增加。此外，通过IP实验，作者发现泛素化的MDC1水平在USP7/WT表达的细胞中有所下降，但在USP7/C223S表达的细胞中没有下降。     

        另一方面，作者进行体外去泛素化试验，发现USP7/WT能够去泛素化MDC1，而USP7/C223S则不能。但是由于依赖磷酸化的MRN-MDC1复合物的组装很难重组，从而阻碍了进一步的研究。

研究结论：USP7针对MDC1进行去泛素化，而且MDC1是去泛素化酶USP7的真正底物。

5.USP7促进的MDC1稳定化被DNA损伤所增强     

        由于MDC1是感知和修复DSBs的重要角色，作者对基因毒性损伤是否会对USP7促进的MDC1的稳定进行研究。实验发现，在细胞暴露于DNA损伤时，MDC1的丰度受USP7的调节。并且USP7和MRN-MDC1复合物之间的物理联系因DNA损伤而增强。     

        接下来，作者测试了USP7是否在DNA损伤时起到去除MDC1聚泛素化链的作用。通过IP实验结果显示，IR暴露导致多泛素化MDC1物种的水平下降，这种效果在USP7敲除后受到影响，而在USP7过表达后得到加强。

研究结论：USP7和MDC1之间的物理互动和功能联系因DNA损伤而加强。

6.MDC1是USP7调节的DDR中的一个重要媒介     

        为了进一步支持USP7促进MDC1稳定的功能意义，作者接下来研究USP7是否能影响MRN-MDC1复合物在断裂区的招募。4-OHT驱动的AsiSI内切酶实验表明， USP7的缺乏导致MDC1病灶在DSB位点的形成急剧丧失。同时，显微镜和活细胞成像分析表明，USP7缺失导致GFP标记的MRE11、RAD50或NBS1在DSB位点的招募受损，其影响可通过MDC1过量表达而基本逆转。     

        USP7促进的MDC1稳定是MRN-MDC1复合物有效积累的必要条件，因此也是细胞对DNA损伤的反应。作者研究了USP7对BRCA1和53BP1病灶形成的影响，这两个病灶在MRN-MDC1复合物的下游起作用，在DDR信号转导中起关键作用。与MRN-MDC1复合物在USP7缺失的细胞中积累的障碍相一致，BRCA1或53BP1病灶的数量在USP7敲除后急剧下降，其效果可以通过MDC1的过表达得到很大的逆转。

研究结论：MDC1是USP7调节的DDR过程中的一个重要媒介。

7.USP7与宫颈癌的发生和病人的生存有关     

        鉴于DDR失调参与促进肿瘤发生的观察，以及USP7在多种恶性肿瘤的发展和进展中的影响，作者推测USP7促进的MDC1稳定在肿瘤发生中起作用。为此，作者首先分析了人类组织中的USP7和MDC1蛋白水平，IHC染色显示，在来自卵巢和宫颈的癌细胞中，3个配对样本中至少有2个出现了USP7和MDC1的上调。作者接下来进行IHC染色，分析来自不同等级的宫颈癌和肿瘤邻近区域的组织学正常宫颈组织的USP7和MDC1的表达情况。染色的定量分析显示，USP7和MDC1在宫颈癌样本中高度表达，其表达水平与宫颈癌的组织学等级相互正相关。此外，对综合癌症芯片数据库Oncomine的分析显示，USP7 mRNA水平在宫颈癌样本中明显上调，对The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据集的拷贝数变异（CNV）分析显示，USP7在宫颈癌中被扩增。重要的是，TCGA数据集的Kaplan-Meier生存分析表明，无论是USP7表达升高还是拷贝数增加，都与宫颈癌患者的不良生存率呈正相关。

研究结论：USP7在宫颈癌中具有促进肿瘤的作用。

8.USP7通过稳定MDC1促进宫颈癌的发生     

        为了检验USP7促进的MDC1稳定化是否与宫颈癌的发生有关，作者通过特定的shRNAs开发了稳定敲除USP7的宫颈癌细胞。菌落形成实验显示，敲除USP7严重阻碍了HeLa细胞（宫颈腺癌）的菌落形成，而MDC1的过度表达可以抵消USP7敲除所诱发的生长缺陷。将这些细胞进一步暴露在不同剂量的X射线产生的IR下，发现USP7被敲除的细胞更容易受到IR的影响，这可以被MDC1的过表达所抵消。     

        为了进一步确定USP7促进的MDC1稳定化在宫颈癌发生和肿瘤对DNA损伤的敏感性中的作用，作者进行了小鼠实验，结果显示，在接受USP7敲除的肿瘤移植的无胸腺小鼠中，肿瘤的生长被大大抑制，而MDC1的过表达可以在一定程度上缓解USP7缺失相关的生长抑制。值得注意的是，USP7的敲除导致肿瘤对IR暴露的敏感性增加，而MDC1的过表达在很大程度上缓解了这种影响。对收获的肿瘤进行的Western blotting和IHC分析表明，USP7耗尽的肿瘤中MDC1的水平明显下降。

研究结论：USP7促进的MDC1稳定保护宫颈肿瘤细胞免受基因毒性的伤害而这又有助于宫颈肿瘤的存活，并最终导致宫颈肿瘤的发生。

结论与讨论

        在这项研究中，作者发现去泛素酶蛋白USP7是早期DDR的一个关键调节器，并揭示了它在调节损伤部位的MRN-MDC1复合物的组装中发挥了重要作用。作者表明, USP7与MRN-MDC1复合物发生物理相互作用，导致MDC1的稳定和MRN-MDC1复合物的积累，并招募53BP1和BRCA1到DSBs。作者发现，USP7在宫颈癌细胞中被扩增，在临床肿瘤样本中，USP7的丰度与MDC1的丰度呈正相关，并与宫颈癌患者的生存率成反比，指出USP7和MDC1是宫颈癌治疗的潜在目标。

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原文链接：https://www.jci.org/articles/view/120518