博奥小课堂 | 教你一个从单细胞转录组数据中分析微生物的方法
微生物在人体多个身体部位与宿主共生，构成了一个复杂的多王国群落。宿主-微生物组的相互作用不仅维持着机体的多种生理状态平衡，而且正常的菌群在一些条件下还会转变为致病菌从而导致疾病的发生。肿瘤组织中的非恶性细胞包围着恶性细胞构成复杂的肿瘤微环境，微环境中细胞类型的组成和丰度不同可能具有促癌或抑癌作用。已有的研究报道表明，至少 33 种主要癌症存在肿瘤内微生物群，且微生物可以存在于细胞内[1]。动物模型研究也表明，肿瘤相关微生物群中的细菌在癌症发展、转移、免疫监测和化学耐药性等方面发挥作用。然而肿瘤内微生物的确切身份、肿瘤内微生物群的空间分布，以及微生物与患者肿瘤细胞或免疫细胞的相互作用尚未被完全揭示，后续癌症发生、诊疗研究中加强对微生物组的分析和理解具有重大的科学意义及临床意义[2]。
2022年10月 Cancer Cell 上发表的题为 Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer 的肿瘤微生物研究，此文章基于单细胞技术开发了 SAHMI 算法来评估宿主-微生物组之间的相互作用，揭示了胰腺癌中肿瘤细胞中存在的特异性的微生物，这部分微生物与细胞类型间基因的差异表达、以及细胞运动和免疫信号传导等功能密切有关[3]。如图 1 所示，SAHMI 读取单细胞 RNA 测序数据的 Reads，采用基于 K-mer 的 Kraken2Uniq 软件进行宿主和微生物参考基因组进行比对，结合噪音数据与真实微生物比对结果间 Kmer 相关性分布的不同，以及单细胞中真实包含微生物与不包含微生物的阴性对照间的 Kmer 分位数分布差异，实现从初步比对鉴定结果中识别并去除噪音污染，保留高可信度的微生物比对鉴定结果。
虽然 SAHMI 对微生物鉴定的准确性在方法学上进行了优化，但是博奥晶典生信团队通过实际数据测试，发现依然存在假阳性的比对结果，且运算时间长，最重要的是没进行 Barcode 矫正，这将直接影响到微生物与单细胞对应关系的准确性，也会间接影响到微生物与细胞类型互作的研究可靠性。据此，我们的生信团队对 SAHMI 做了改进，采用 CellRanger 实现单细胞 Barcode 的矫正，选取未比对到宿主的序列进行后续微生物比对分析，增加了 K-mer 分类算法的置信度 confidence ，而且使运行时间大大减少，单细胞微生物鉴定的准确性和效率均明显提高。
单细胞测序微生物检测总体分析结果如图2所示，横坐标是鉴定全部微生物对应的不同的属水平，纵坐标（左）对应柱状图的高低，表示全部单细胞测序数据中比对到此微生物属的总 Reads 数，纵坐标（右）累积曲线表示累积的百分比，整个图从左至右，排在第一位的类芽孢杆菌 Reads 的比例占到了全部 Reads 的 64%，与第二位的支原体累加到一起占全部微生物 Reads 的 90%。
具体到每个细胞中是否检测到微生物的分析结果见图3，该图展示了单细胞转录组数据的 tSNE 分布，图中红色的细胞表示检测到了微生物，蓝色的细胞表示没有检测到微生物，可以看出微生物相关细胞的分布情况。后续也可结合细胞类型注释的结果，分别统计每种细胞类型下包含微生物的细胞的比例等信息。
本文介绍了 SAHMI 在单细胞测序数据中微生物检测的应用，及博奥晶典生信团队对 SAHMI 算法的改进，提示了微生物组检测在肿瘤研究中的新应用方向，但并非说单细胞测序数据的微生物检测只能应用于肿瘤组织样本，其同样适用于感染类传染病如 HBV、COVID-19 等患者的单细胞测序数据的微生物检测。
参考文献：
[1] Galeano Niño JL, Wu H, LaCourse KD, Kempchinsky AG, Baryiames A, Barber B, Futran N, Houlton J, Sather C, Sicinska E, Taylor A, Minot SS, Johnston CD, Bullman S. Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer. Nature. 2022 Nov;611(7937):810-817.[2] Cullin N, Azevedo Antunes C, Straussman R, Stein-Thoeringer CK, Elinav E. Microbiome and cancer. Cancer Cell. 2021 Oct 11;39(10):1317-1341.[3] Ghaddar B, Biswas A, Harris C, Omary MB, Carpizo DR, Blaser MJ, De S. Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2022 Oct 10;40(10):1240-1253.e5.
