聊聊兰尼碱/ryanodine受体2型(1):钙与兰尼碱【不正经科普】

Long long ago,我立了个给RyR2写科普的flag,然后就麻利地把这茬儿给忘了……(RyR2对不起!)咳咳,不管怎么说,既然现在想起来自己挖过的坑了,再不往坑里填几铲子土感觉就真对不住RyR2了,所以无论如何就从现在开始吧。这个系列文章的内容大多很长,风格比较口语化,类似于八卦谈闲天,被八卦聊到的主角当然是RyR2,当然与它相关的任何东西都可能成为谈资;另外,要想获得最佳阅读体验,读者(如果真有人看的话)需要对离子通道、细胞生物学、电生理学等有一些基础的了解。好了,废话少说(然而你废话已经不少了),是时候进入正题了!

如标题所述,本文绝大多数内容都会跟一个名叫兰尼碱受体2型(ryanodine receptor 2, RyR2)的可能与钙有关联的东西扯上关系。具体点讲,本文及本系列的主角RyR2以及和它同在RyR家中的兄弟们都是钙离子通道,而且与一般印象里质膜上的通道们不同,它们定位在内质网(endoplasmic reticulum, ER)或肌质网(sarcoplasmic reticulum, SR,如果是在肌细胞——比如我接下来会经常提到的心肌的话)膜上,把守这个胞内最大钙库的出口,因而别号“内钙释放通道”。
除开RyR家之外,守着钙库出口的通道还有一家,它们就是大名鼎鼎的肌醇-1,4,5-三磷酸受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, IP3R)。可以注意到,这两家通道的大名都是“某某受体”,这多少暗示了它们可能是配体门控的钙通道。不过……IP3R的配体是IP3倒还好理解,RyR名字里那个ryanodine又是什么玩意儿啊!这个就连中文翻译都没法统一的东西当真是它应该结合的东西吗??
额……说得不错。一般被我叫做兰尼碱的ryanodine的确不是RyR的天然配体,但就像遗传学家们有把基因按照突变造成的XX表型取名为XX基因的风俗,生理学家们也有把蛋白按照其特异结合的某某物质取名为某某受体的传统,——尽管这个某某物质不见得是蛋白的天然配体。比方说,L型钙通道别名二氢吡啶受体(dihydropyridine receptor, DHPR),就是因为它们能与二氢吡啶类钙通道阻滞剂(包括硝苯地平、氨氯地平等)特异结合;RyR们之所以叫做兰尼碱受体,也正是因为它们最早是以“能与兰尼碱特异结合的东西”的身份被发现的。兰尼碱长这样:

看起来的确不像是RyR们生理状态下该结合的东西。确实,它是种二萜类生物碱,因为提取自一种名叫Ryania speciosa(没找到翻译……)的杨柳科热带植物而被命名为ryanodine(兰尼碱)。这植物长这样:

它是在1796年由丹麦植物学家Martin Vahl报道并命名的,取名时纪念了一下给他提供了很多植物标本的医生John Ryan。这个植物的提取物能用来做杀虫剂,不过直到150多年后的1948年,人们才第一次分离纯化出可以杀虫的活性成分,也就是兰尼碱。大家很快就注意到兰尼碱拥有强悍的麻痹肌肉的能力,无论是骨骼肌还是心肌都统统不在话下。不过,兰尼碱对骨骼肌和心肌的作用有着一个神奇的区别:它能使骨骼肌发生痉挛性麻痹,却使心肌发生弛缓性麻痹。也就是说,骨骼肌遇上它就会不受控制地疯狂收缩,心肌碰上它的后果却恰恰相反。
都是横纹肌,都是同一个生物碱,麻痹的风格怎么还不一样了呢?这一现象令当时的研究者们百思不得其解,也刺激了人们对这个神奇的生物碱与肌肉间的关系进行更多研究。那时,人们已经注意到横纹肌胞浆钙浓度的少量增加会引起来自SR的大规模钙释放,从而触发肌肉收缩,这就是为肌肉的兴奋-收缩偶联打下基础的重量级机制——钙诱导钙释放(calcium induced calcium release, CICR)。从这个地方入手,有人发现兰尼碱可以与SR膜上的一个蛋白结合,从而抑制SR的钙释放。这个神秘的兰尼碱结合蛋白被纯化出来之后,研究者们试着用电镜给它拍了拍照片,没想到不看不知道、一看吓一跳,这玩意儿怎么跟之前用电镜拍肌肉时发现的SR和T管膜之间的那些个“足状结构”那么像啊!再后来,人们对它做了更多检查,确定它是个离子通道,而且是个选择性没那么高(对钙与钾的通透性之比只有6左右;举个选择性高的例子作为比较,电压门控钠通道Nav 1.4几乎不能使钙透过,对钠与钾的通透性之比可达30左右)、电导巨大(钾载荷时约700pS,钙载荷时也有约100pS;一般来说,超过100pS的电导对离子通道而言就已经很大了)的同源四聚体通道。上述故事中作为主角的RyR实际上是骨骼肌中主要的钙释放通道RyR1,因为最初这一系列研究都是在骨骼肌里做的;接下来,按照发现的顺序,在心肌发现的RyR亚型被命名为RyR2,还有个最初在脑组织中发现的RyR3。从“横纹肌SR上有个东西能跟兰尼碱结合”开始,到成为家族中第二个被鉴定出的成员,我们的RyR2就是这样得到它看起来有点怪怪的名字的。嗯,是个不错的故事;但是,总感觉哪里还有点不对……
等等!之前说到兰尼碱对骨骼肌和心肌作用的不同,到头来还是没解释为啥会有不同啊!
呃……抱歉,现在还不是把它彻底说明白的时候。因为这个不同实质上反映的是骨骼肌和心肌钙稳态调控机制上的不同,而本文主要介绍RyR2以及RyR家族作为配体门控通道的特征,还没到具体讲它工作生活的时候。
不过,骨骼肌和心肌的内钙调控机制不同,RyR们对兰尼碱的反应倒差不多。兰尼碱对它们的亲和力高得不可思议(纳摩尔浓度就能轻轻松松地结合上去),而且这一结合特异性相当高(不然为啥叫RyR呢),因而经常被用来作为“诱饵”分离纯化RyR,或是在单通道实验中确定通道的身份。兰尼碱的作用具有两个特性:第一个叫使用依赖性,意思是它只与开放状态下的RyR结合,所以你可以看到人们用同位素标记的兰尼碱测定RyR通道的稳态开放水平。第二个叫剂量依赖性,这个比较有意思:在低浓度(大概低于10微摩尔即可,在纳摩尔浓度也管用)下,兰尼碱可以将RyR锁定在一直不关上但也没完全打开的状态,也就是亚传导状态(sub-conductance state)下;此时,钙会不断地通过RyR流入胞质内,最后钙库可能会被榨干。假如说浓度高一点(大于等于100微摩尔左右),兰尼碱则会把RyR锁死在关闭状态,让钙死活释放不出来。大多数地方都会像这样简单地告诉你高浓度兰尼碱抑制RyR,不过其实这个现象的细节是相当有趣的:实际上,刚遇上高浓度兰尼碱时,RyR的反应跟遇到低浓度兰尼碱一模一样,即进入高开放概率、低电导的亚传导状态;然而时间一长它就蔫儿了,进入彻底想不开状态,你等上天荒地老都不会等出什么变化来。这些都暗示着RyR们身上具有多个对兰尼碱亲和力不同的结合位点,不过很遗憾,目前兰尼碱对RyR作用的具体机制依然尚未解明。
说了这么多兰尼碱,到头来它也只是个外源配体,作为研究工具的意义很大,在生理学上却实在没有特别大的意义(而且我也不希望我身体里的RyR们真的碰到它)。而在这方面上,论谁最有生理意义的话,恐怕钙离子说第二无人敢称第一。当然,可以直接激活RyR的第二信使环腺苷二磷酸核糖(cyclic adenosine diphosphate-ribose, cADPR)估计有几句话要说,但我还是打算把它放到将来专门说调控的时候来讲。接下来我们的主要讨论对象将会从泛指的RyR家变成RyR2,要不然就跑题了毕竟它才是我们的主角嘛。

作为工作心肌收缩所需钙的主要供应者(贡献了90%左右),RyR2最重要的看家本事就是对L型钙通道介导的钙内流作出滴水之恩涌泉相报的反应。不过,这样式的反应似乎有安全隐患:钙能激活RyR2,而RyR2激活之后又会释放更多的钙——居然是个正反馈循环!好家伙,这可是在心肌啊,万一这过程停不下来了或是乱套了该怎么办呢?我当然知道正反馈在这儿很有用,因为这确保了CICR能够实现自扩布(self-propagation),使钙释放传遍全SR(重要提示:这里说“全SR”只是为了方便,其实RyR2不是均匀分布于整个SR膜上的,而是集中在所谓的交界区SR或终嵴上;不过现在还不到说这些的时候);但问题是,这么一个本质上不稳定的过程是如何整齐划一地停下来的?毕竟,假如CICR不能好好停下来,或者停下后又在不该发生的时候发生了,可是会搞出很大的麻烦的!
Hmmmm……好问题。CICR的终止机制的确是困扰着学界的一大谜团,其核心机制——RyR2们协调一致地关闭的机制——也堪称兴奋-收缩偶联研究中的世界难题。不过,毫无疑问,RyR2自身对钙离子浓度的实时感受与反应肯定参与了其中。先把这个谜题记在心里吧,我们接下来就要谈到钙离子对RyR2的直接调控,期间时不时地就会提到关于它的事,或许能给你一些启发。
毕竟RyR2介导CICR,细胞质里的钙能直接激活RyR2大概是很显然的事情。有趣的是,就像和钙一起出现在小标题里的那个兰尼碱一样,胞浆内钙离子对RyR2开放概率(Po)的作用也是有剂量效应的:略微升高的钙浓度激活它,更高的钙浓度却抑制它。确切来讲,RyR2在环境钙浓度达到10~100纳摩尔时开始激活,1~10微摩尔时激活程度达到最高;比这再多的钙则起到抑制作用,最强的抑制作用出现在10毫摩尔。值得注意的是,上述的最强激活效果是在环境中存在约1毫摩尔的ATP时被观察到的。另外,生理状态下胞质中还存在约1毫摩尔的镁离子,这些镁离子能抑制RyR2的Po,不知道是通过竞争钙结合位点、与别构抑制位点结合、占据钙离子通行孔道还是别的什么机制发挥作用的。
目前在RyR2已鉴定出的胞质钙感受位点处于3987号谷氨酸(E3987)附近,把这个关键氨基酸残基突变成无法同钙相互作用的丙氨酸后,胞质内钙对RyR2的激活作用便会几乎完全消失。不过,很可惜,RyR2感受胞质钙的分子细节并没有这么简单。E3987可能算是最重要的(毕竟它极可能与钙离子直接结合),但除它之外还有数都数不清的氨基酸残基在精细地调节RyR2对钙反应的细节。举个属于病理生理学范畴的栗子,离E3987有点距离的4751号氨基酸是个赖氨酸(K),把它突变成谷氨酰胺(Q;这个突变写作K4751Q)后,RyR2不仅会对胞质内钙的激活过度反应(敏感性提升),还会变得完全不受胞质内高浓度钙的抑制!不用我说,这百分之百会出大问题,要不然我前面也不会说“属于病理生理学范畴”了。
如果你比较细心的话,可能会注意到上两段我措辞的一个小细节:几乎所有提到钙的时候,我都会专门强调是胞质里的钙。这是因为,除了盯着胞质内钙的浓度外,RyR2还时刻感受着SR腔内的游离钙浓度,其中最可能与钙离子直接发生相互作用的关键氨基酸残基是4872号谷氨酸(E4872)。注意,它能直接感受的是*游离*钙浓度,因为正常状态下SR有很大一部分钙是被缓冲蛋白结合着的。某个RyR2身下局部游离钙浓度非常低时,比如说刚释放了不少钙的时候,它的Po就会受到抑制。这样的性质除了参与CICR终止的调节外,还很可能与CICR的“不应期”(refractory period)有关系。这个不应期的概念跟可兴奋组织的不应期基本一样,就是说每次CICR完成后都会有那么一小段时间不能再发生下一次。尽管有不止一种钙感应机制参与其中,但局部低钙浓度对RyR2的抑制很可能也起了作用。研究表明,当SR内的钙缓冲机制出现问题时,CICR的不应期可能会异常缩短,并引发包括而不限于RyR2在不该激活的时候激活等一系列麻烦。
另一方面,局部游离钙浓度升高时,RyR2对胞质内钙激活作用的敏感度也会提高;当局部游离钙浓度特别高时,RyR2不需什么外部刺激就会自动自发地开放,释放些钙出来。这一现象被称为容量超载诱导的钙释放(store overload induced calcium release, SOICR)。对正常的RyR2来说,足以引发SOICR的局部游离钙浓度(即SOICR阈值)实在太高了,在生理状态下基本上不可能发生;但假如说出于无论什么原因,RyR2的SOICR阈值下降了,那就很不好说了。举个用过了的栗子,K4751Q突变也能大大降低RyR2的SOICR阈值。一个氨基酸的改换就能使RyR2的行为发生如此翻天覆地的变化,或许这就是差之毫厘谬以千里吧……
钙离子对RyR2的*直接*调节已经差不多说完了,本文的目的——从生理配体钙与工具药兰尼碱入手,阐述RyR2作为配体门控通道的一些性质——也就基本达到了。你肯定会说,按理来说系列第一篇文章应该是那种大致介绍之类的,你个ATP怎么反倒写个这呢?但讲道理(不,其实你没有道理),我说过了本系列的风格比起正儿八经的科普抑或讲座更像是吊儿郎当的闲聊甚或八卦,而闲聊这种东西基本就是扯到哪说到哪,介绍什么的无所谓啦!(还狡辩!)……咳咳,无论如何,本文到这里就算结束了。下一次(如果我能想起来的话)的闲聊内容将会围绕着RyR2的结构和工作环境展开,顺便去跟那群调控它的蛋白质小伙伴儿们见个面。
再多说一句:本文所属的文集名字是我瞎想的,没什么特别意义~不过,某种程度上,《存在主义咖啡馆》这本书可能给了我起它的灵感……

封面和头图是我自己拍的,上镜的是自己拼的兰尼碱球棍模型和兰尼碱的维基百科页面~看起来莫名地寒酸呢……
参考文献兼拓展阅读:
Blayney, LM., and Lai, FA. Ryanodine receptor-mediated arrhythmias and sudden cardiac death. Pharmacol Ther 123, 151-177 (2009). DOI: 10.1016/j.pharmthera.2009.03.006
备注:时间古早了些但依然有趣的综述,可以算作我的入门读物之一。
Kannankeril, PJ. Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia. Encyclopedia of Cardiovascular Research and Medicine, 542-552 (2018). DOI: 10.1016/B978-0-12-809657-4.99795-3
备注:你可能很难想象Ryania speciosa这个植物名字来源的故事(甚至包括Vahl报道它的精确年份)是我在《心血管研究与医疗百科全书》上找到的吧……不论怎么说,这章所描述的疾病(也就是此章作者名字后面那四个令人望而生畏的词(笑))的确跟RyR2有很大关系,以至于对RyR2感兴趣的人很难不知道它。具体嘛……回头再说咯!
Fill, M., and Copello, JA. Ryanodine Receptor Calcium Release Channels. Physiol Rev 82, 893-922 (2002). DOI: 10.1152/physrev.00013.2002
备注:除R. speciosa名字来源之外的RyR研究史出自这儿。你可以从它当中找到兰尼碱对骨骼肌和心肌不同作用的缘由。
Lipkind, GM., and Fozzard, HA. Voltage-gated Na Channel Selectivity: The Role of the Conserved Domain III Lysine Residue. J Gen Physiol 131, 523-529 (2008). DOI: 10.1085/jgp.200809991
备注:Nav 1.4选择性数据的出处。大概是参考文献中唯一一个与RyR无关的……
Thomas, NL., and Williams, AJ. Pharmacology of ryanodine receptors and Ca2+-induced Ca2+ release. Wiley Interdiscip Rev Membr Transp Signal 1, 383-397 (2012). DOI: 10.1002/wmts.34
备注:高浓度兰尼碱对RyR作用细节的出处。
Xiao, Z., Guo, W., Sun, B., Hunt, DJ., Wei, J., Liu, Y., Wang, Y., Wang, R., Jones, PP., Back, TG., and Chen SRW. Enhanced Cytosolic Ca2+ Activation Underlies a Common Defect of Central Domain Cardiac Ryanodine Receptor Mutations Linked to Arrhythmias. J Biol Chem 291, 24528-24537 (2016). DOI: 10.1074/jbc.M116.756528
备注:这篇研究的是一批RyR2突变的致病机理,不过我把它引在这里主要是因为它里面有个很好看的RyR2关键位点示意图,当年正是它让我阴差阳错地第一次知道了RyR2胞质与SR内钙感受位点的确切位置。这张图(的一部分)大概率会在本系列下一篇中出现。
Uehara, A., Murayama, T., Yasukochi, M., Fill, M., Horie, M., Okamato, T., Matsuura, Y., Uehara, K., Fujimoto, T., Sakurai, T., and Kurebayashi, N. Extensive Ca2+ leak through K4750Q cardiac ryanodine receptors caused by cytosolic and luminal Ca2+ hypersensitivity. J Gen Physiol 149, 199-218 (2017). DOI: 10.1085/jgp.201611624
备注:K4751Q突变的出处。这篇的研究材料是小鼠的RyR2,人RyR2的4751号赖氨酸对应到小鼠里变成了4750号赖氨酸,所以你可以看到标题里写的是K4750Q。之所以我会举这个例子,部分原因是这个突变对RyR2的功能影响之大令我受到了深深的震撼,至今难忘……如果没时间读正文的话,也可以看看这篇名叫A missense mutation makes a mess of Ca2+ sensing的评论文章(https://doi.org/10.1085/jgp.201611750)大致了解一下。
Koenyeyev, D., Petrosky, AD., Zepeda, B., Ferreiro, M., Knollmann, B., and Escobar, AL. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol 52, 21-31 (2012). DOI: 10.1016/j.yjmcc.2011.09.020
备注:一篇相当有趣的涉及到CICR不应期的研究。如果你按捺不住自己对“钙缓冲机制出现问题时,CICR的不应期可能会异常缩短”的好奇的话,可以先读读看。
最后,参考列表里当然不能少了万能的Wikipedia。