USP20通过解偶联K48相关的MITA泛素化促进细胞抗病毒反应

写在前面

        今天推荐的是由武汉大学生命科学学院在2020年12月7日发表于The Journal of Immunology（2020IF：5.422，JCRQ2）的一篇文章，通讯作者是Dandan Lin教授，研究表明USP20通过解偶联K48相关的MITA泛素化促进细胞抗病毒反应。

研究背景

        IRF3激活的介质（[MITA]也称为STING）是环状二核苷酸的直接传感器，并介导细胞质DNA触发的先天免疫信号。MITA的活性受到泛素化和去泛素化的广泛调节。

摘要部分

        在这项研究中，作者发现USP20在HSV-1感染后与K48连接的泛素链相互作用并从MITA中去除，从而稳定MITA并促进细胞抗病毒反应。USP20的缺失会加速HSV-1诱导的MITA降解并损害IRF3和IkBa的磷酸化以及随后在HSV-1感染或细胞质DNA作用后诱导I型干扰素和促炎细胞因子。与Usp20+/+小鼠相比，Usp20-/-小鼠产生的I型干扰素和促炎细胞因子减少，对致死性HSV-1感染的易感性增加，HSV-1复制加剧。此外，将MITA补充到Usp20-/-细胞中可以完全恢复HSV-1触发的信号传导并抑制HSV-1感染。这些发现表明USP20在维持MITA的稳定性和促进先天抗病毒信号传导方面发挥着关键作用。

研究内容

1.USP20缺陷会损害DNA病毒触发的信号

        作者之前证明USP20在HSV-1感染后可以去泛素化并稳定MITA。作者绘制了USP20与MITA相互作用的域，发现UCH域（aa150-700）与MITA相关。为了进一步研究USP20在体内抗病毒信号传导中的作用，作者构建了USP20缺陷小鼠。Usp20-/-小鼠生长发育正常。作者接下来通过将GFP标记的USP20和Cherry标记的MITA转染到Usp20-/-BMDC中来检查USP20和MITA的细胞定位。结果表明，HSV-1感染后，部分USP20和MITA共定位于细胞质中。HSV-1感染导致MITA的点状形成，这是MITA激活的标志。有趣的是，作者发现敲除USP20并不影响HSV-1感染后MITA的点状形成。

        作者接下来用Usp20+/+和Usp20-/-细胞探究了USP20是否在DNA病毒触发的下游基因表达中起作用。qRT-PCR分析结果表明，在感染HSV-1或转染各种DNA配体后，与野生型对应物相比，Usp20-/-BMDCs和BMDMs中Ifnb、Ip10、Il6或Isg56的诱导显着降低。免疫印迹分析表明，与野生型对应物相比，HSV-1诱导的IRF3、IkBa、USP18和p65磷酸化在Usp20-/-BMDC或BMDM中显着受损。此外，敲除BMDC和BMDM中的USP20也显着影响了IFN-b和TNF的产生。另一方面，通过HSV-1UL30基因的表达、上清液中的HSV-1滴度或H129-G4的GFP百分比监测，与野生型对应物相比，HSV-1在Usp20-/-BMDC中HSV-1病毒的复制得到加强。

研究结论：USP20在各种原代小鼠细胞中正向调节DNA病毒触发的信号。

2.USP20对于RNA病毒触发的信号转导不是必须的

        作者接下来检查了USP20是否在RNA病毒触发的信号传导中起作用。qRT-PCR分析表明，与野生型细胞相比，仙台病毒(SeV)或脑心肌炎病毒(EMCV)诱导的Ifnb、Ip10和Il6表达在USP20缺陷型BMDC和MLF中相当。一致地，敲除USP20不会抑制SeV或EMCV诱导的IRF3或IkBa磷酸化。此外，细胞内poly(I:C)诱导的Ifnb、Ip10和Il6表达不受USP20敲除的影响。这些数据共同表明USP20对于RNA病毒触发的信号传导不是必需的。接下来，作者探究USP20是否影响I型IFN介导的抗病毒反应。野生型和Usp20-/-MLF用H129-G4或HSV-1感染后，在有无IFN-α的培养基中培养24小时，然后进行荧光显微镜检查、流式细胞术或qRT-PCR分析。结果表明，野生型和Usp20-/-细胞之间的GFP强度或百分比或HSV-1UL30基因的mRNA水平相当。此外，敲除USP20对IFN-α诱导的STAT1磷酸化没有影响。这些数据共同表明USP20不调节I型IFN信号传导或I型IFN介导的抗病毒反应。

研究结论：USP20对于RNA病毒触发的信号转导不是必须的。

3. USP20缺陷小鼠更容易感染HSV-1

        作者接下来探究了USP20在体内DNA病毒感染中的功能。Usp20+/+和Usp20-/-小鼠静脉注射HSV-1并连续八天监测。与基因诱导分析的结果一致，Usp20-/-小鼠比Usp20+/+小鼠更容易受到致死性HSV-1感染。此外，在HSV-1感染后12小时，与Usp20+/+小鼠相比，Usp20-/-小鼠血清中IFN-b、IL-6和CCL5的诱导显着降低。另一方面，与Usp20+/+小鼠相比，在HSV-1感染后,来自Usp20-/-小鼠的肺和脑中Ifnb和促炎细胞因子的表达严重受损，并且HSV-1的复制加剧。斑块测定的结果进一步证实，与野生型对照相比，USP20缺乏导致Usp20-/-小鼠在感染后肺和脑中的HSV-1滴度增加。

研究结论：USP20正向调节病毒诱导的下游基因表达，并且对于宿主体内针对DNA病毒的防御至关重要。

4.USP20介导抗病毒信号依赖于其DUB活性     

        作者之前已经表明USP20的DUB活性是MITA去泛素化所必需的。为了证实USP20 DUB活性在调节HSV-1触发的体内信号传导中的重要作用，作者将WT USP20或其酶失活突变体USP20（C560/563S）转染到Usp20-/-细胞随后感染HSV-1感染或转染ISD。qRT-PCR和ELISA分析的结果表明，HSV-1或细胞溶质DNA诱导的Ifnb和Ip10表达以及IFN-b和TNF的产生在用USP20回补的Usp20-/-MLF中得到显着恢复，用USP20突变体回补则没有效果。

此外，HSV-1诱导的IRF3或IkBa的磷酸化因USP20而不是USP20（CS）的回补在Usp20-/- MLFs中增加。一致地，HSV-1的复制在用USP20回补的Usp20-/-MLF中得到加强，但在用USP20(CS)回补的对照组中没有。

研究结论：USP20介导的DNA病毒触发信号增强需要其去泛素化酶活性。

5.USP20解偶联K48连接的泛素化并稳定MITA     

        作者之前已经证明，在HSV-1感染后，USP20的敲低会导致THP-1细胞中K48相关的MITA泛素化增加。与这些观察结果一致，与Usp20+/+MLF相比，HSV-1诱导的K48连接的MITA泛素化在Usp20-/-MLF中显着增加。将USP20而不是USP20(CS)回补的Usp20-/-MLFs削弱了HSV-1诱导的K48连接的MITA泛素化，表明USP20在病毒感染后从MITA中去除了K48连接的多泛素链，这可能会控制MITA的蛋白质稳定性。

        为支持这一观点，在感染HSV-1后，敲除USP20促进了MITA的降解。此外，HSV-1或细胞质DNA诱导的MITA降解被蛋白酶体抑制剂MG132阻断，但在Usp20-/-MLF中不受自噬抑制剂3MA的阻断。这些数据共同表明，USP20通过解偶联K48连接的MITA泛素化，促进MITA的稳定。因为在USP20缺陷细胞中MITA的降解加速，作者假设将MITA补充到USP20敲除细胞中将恢复病毒触发的下游基因表达。正如作者预期的那样，将MITA重组到Usp20-/-MLFs中恢复了HSV-1感染后IRF3和IkBa的磷酸化以及Ifnb、Il6和Ip10的表达。如通过H129-G4的GFP信号或上清液中的HSV-1滴度所示，HSV-1的复制在用MITA重建的Usp20-/-MLF中受到抑制。

研究结论：MITA是USP20在调节细胞对DNA病毒感染的抗病毒反应方面的主要目标。

结论与讨论

        在这项研究中，作者生成了USP20缺陷小鼠，并探究了USP20在先天抗病毒信号传导中的作用。作者发现USP20的敲除会损害DNA病毒触发的IRF3和NF-kB激活以及下游基因的表达，并促进K48相关的泛素化HSV-1感染后MITA的蛋白酶体降解。一致地，USP20缺陷导致细胞和体内HSV-1复制增强, USP20缺陷小鼠对致死性HSV-1感染的易感性增加。作者的研究结果提供了证据,表明USP20通过靶向MITA进行去泛素化,在细胞抗病毒反应中发挥重要作用。

Thank you!

原文链接：https://doi.org/10.4049/jimmunol.1801447