A Novel lncRNA Panel Related to Ferroptosis, Tumor Progression, and Microenvironment is a Robust Prognostic Indicator for Glioma Patients

摘要：

目的：建立与铁死亡、肿瘤进展和微环境相关的 lncRNA panel，用于胶质瘤患者的预后评估。

方法：通过加权基因共表达网络分析 (WGCNA) 筛选与肿瘤进展和微环境相关的 LncRNA。WGCNA 中突出显示的与铁死亡相关的重叠 lncRNA，并纳入中国神经胶质瘤基因组图谱（CGGA）被确定为中心 lncRNA。利用中枢 lncRNA 的表达谱，我们进行了最小绝对收缩和选择算子 (LASSO) 回归，并建立了与铁死亡相关的 lncRNA 特征，以区分具有不同生存结果的胶质瘤患者。使用 Kaplan-Meier 生存分析和 ROC 曲线在 TCGA、CGGA_693 和 CGGA_325 队列中验证了 lncRNA 特征。使用定量实时 PCR (qRT-PCR) 对 15 个胶质瘤样本验证了与铁死亡相关的 lncRNA 面板。进行多变量 Cox 回归，并绘制并验证了列线图。使用 TIMER 和 CIBERSORT 算法探索与签名相关的免疫浸润。

结果：本研究确定了 30 个与铁死亡、肿瘤进展和微环境相关的中枢 lncRNA。使用 30 个中心 lncRNA，我们开发了一个 lncRNA 特征，在两个独立队列（HRs>1，p< 0.05)。lncRNA 签名揭示了一组 14 个 lncRNA，即 APCDD1L-AS1、H19、LINC00205、LINC00346、LINC00475、LINC00484、LINC00601、LINC00664、LINC00886、LUCAT1、MIR155HG、NEAT1、PVT1 和 SNHG18。使用 qRT-PCR 在临床标本中验证了这些 lncRNA 表达。在多个时间点的不同数据集中存在强大的签名预测准确性。通过单变量和多变量回归，我们证明基于 lncRNA 特征的风险评分是调整临床因素后的独立预后指标。用这些预后因素构建了一个列线图，它已经证明了不错的分类和准确性。此外，观察到基于特征的分类与多种临床特征和分子亚型相关。更远，+ T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和骨髓树突状细胞，表明免疫浸润增加。

结论：我们建立了一种新的铁死亡相关 lncRNA 特征，可以有效地对胶质瘤患者的预后进行分层，并具有足够的预测性能。

关键词：长链非编码RNA，预后特征，神经胶质瘤，癌症基因组图谱，中国神经胶质瘤基因组图谱

结果

Hub Long非编码RNA的鉴定和富集分析

本研究的流程图呈现在图1. 使用 WGCNA 包，我们执行了层次聚类并检测到一个异常值（图 2A）。Scale-free R 2中的截止值为0.95 ，软阈值功率设置为5（图 2B）。聚类树状图识别了 14 个模块（图 2C），其中绿松石模块与肿瘤分级以及肿瘤微环境显着相关（Cor>0.5，图 2D）。具体而言，突出显示了肿瘤分级、ESTIMATE 综合评分、基质评分和免疫评分等特征。turquoise 模块中上述特征的 GS 与 MM 的散点图表现出显着的相关性，表明这些 lncRNA 在 turquoise 模块中的功能意义。图 2E-H）。因此，总共选择了嵌入 turquoise 模块中的 1223 个临床相关 lncRNA。

预后特征的开发和验证

在 turquoise 模块中的 1223 个 lncRNA 中，303 个 lncRNA 与铁死亡有关。将 303 个与铁死亡相关的 lncRNA 与 CGGA 的基因列表相交后，我们检索到了 30 个中心 lncRNA。图 3A）。30 个中枢 lncRNA（列）和铁死亡相关基因（行）的表达之间的相关性在图 3B. 显示 30 个中心 lncRNA 预后价值的森林图在图 3C. 使用 30 个中心 lncRNA，我们使用 TCGA 数据集通过 Lasso 回归选择了 14 个关键 lncRNA。图 4A、B）。如图所示图 4C，14个lncRNA如下（模型系数绝对值增加）：APCDD1L-AS1、H19、LINC00205、LINC00346、LINC00475、LINC00484、LINC00601、LINC00664、LINC00886、LUCAT1、MIR155HG、NEAT1、PVT1和SNHG18。除了LINC00205的风险评分为负系数，表明其对预后有保护作用外，其他lncRNA被观察为具有正系数的风险因素（图 4C）。随后，我们在提取系数后用 14 个 lncRNA 的系数加权表达水平计算了个体化风险评分。以 3.04 的中位风险评分为临界值，将 TCGA 胶质瘤患者分为高分组和低分组。在生存分析中这两组之间显示出显着差异（图 4D, HR = 3.1, 95% CI = 2.7–3.6, p < 0.001)。TCGA-胶质瘤患者特征的 ROC 曲线分析在 1 年、3 年和 5 年时的 AUC 分别为 0.853、0.856 和 0.825。图 4E）。风险图清楚区分了风险组之间的生存状态，红点表示停止病例，蓝点表示存活病例（图 4F）。同样，我们计算了 CCGA_693 和 CGGA_325 胶质瘤患者的个体化风险评分，并将其分为具有相同临界值 (3.04) 的高风险和低风险组。与低危组相比，高危组患者预后较差（图 4G,J）。CGGA_693 中特征的 ROC 曲线分析在 1 年、3 年和 5 年的 AUC 分别为 0.719、0.783 和 0.782，表明特征在预测患者生存率方面具有中等高的敏感性和特异性。图 4H）。在基于 CGGA_325 (图 4K）。此外，我们揭示了风险评分和生存状态的分布模式，发现高风险评分患者的生存时间明显低于低风险评分患者。图 4I、4L）。

评估预后特征的独立性

我们接下来试图确定基于 lncRNA 特征的风险评分是否是胶质瘤患者 OS 的独立预后指标。风险评分和几个临床病理学变量，如性别、年龄、等级、IDH 突变状态、1p19q 共缺失状态、MGMT 启动子甲基化状态、放疗和化疗被包括在单变量和多变量 Cox 回归分析中。单因素 Cox 回归分析显示，风险评分、年龄、分级、放疗、IDH 突变状态、1p19q 共缺失状态和 MGMT 启动子甲基化状态与胶质瘤患者的 OS 显着相关，而性别和化疗未显示任何相关性。图 5A，左面板）。通过多变量分析，四个变量被进一步确定为 OS 的独立预后因素，包括风险评分 (HR = 2.257, 95% CI = 1.437–3.544, p < 0.001)、年龄 (HR = 1.040, 95% CI = 1.022–1.059, p < 0.001)、分级 (HR = 2.130, 95% CI = 1.365–3.324, p < 0.001) 和放疗 (HR = 0.507, 95% CI = 0.279–0.920, p = 0.026) (图 5A，右面板）。此外，亚组生存分析显示，该特征预测化疗组的总生存期（图 5B), 没有化疗 (图 5C), 放疗 (图 5D)，并且没有放射治疗 (图 5E）。

借助上述独立的预后因素，我们建立了一个用于预测个体 OS 的列线图。如中所述图 5F，临床医生可以直观地预测年龄、肿瘤分级和风险评分已知的个体的生存结果。1 年、3 年和 5 年生存预测的分类准确度分别为 0.941、0.964 和 0.897（图 5G）。此外，还使用校准图评估了预测准确性，这表明基于列线图的预测与术后 1 年、3 年和 5 年的实际生存率高度一致。图 5H）。

预后分类器的临床相关性

如图所示图 6A，预后分类器与多种临床特征显着相关，包括年龄、分级、化疗、放疗和 MGMT 启动子甲基化状态、1p19q 共缺失状态和 IDH 突变状态（p < 0.001）。值得注意的是，lncRNA 特征和等级之间的相关性非常显着。此外，我们分析了高级别和低级别样本之间的 14 个 lncRNA 特征的表达，组间结果不同（p < 0.001）（图 6B）。

使用定量实时 PCR 验证长非编码 RNA 表达

在 14 个 lncRNA 中，与 LGG 相比，PVT1 和 SNHG18 在胶质母细胞瘤样本中的高表达在之前的研究中得到了验证（Zheng 等人，2021 年）。同样，与 LGG 相比，在高级别胶质瘤中报告了 lncRNA MIR155HG ( He et al., 2021 )。因此，我们在此验证了临床标本中的其他 11 个 lncRNA。如图所示图 6C, 我们成功验证了 11 个 lncRNA, 即 APCDD1L-AS1, H19, LINC00205, LINC00346, LINC00475, LINC00484, LINC00601, LINC00664, LINC00886, LUCAT1, NEAT1 (q < 0.0001)。除 LINC00205 外，所有其他 lncRNA 在 HGG 中均上调（图 6C、D）。

高危人群的免疫浸润

使用 TIMER 算法，我们确定了高危组中上调的四种免疫细胞，即 CD8 + T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和髓系树突状细胞。图 7）。使用 CIBERSORT 算法，识别出更广泛的免疫细胞成分，例如 B 细胞记忆、T 细胞 CD4 +记忆（静息和激活）、巨噬细胞（M0、M1 和 M2）和肥大细胞激活。这些结果表明，在由铁死亡相关的 lncRNA 特征定义的高风险组中，免疫浸润增加。图 7）。

讨论

由于胶质瘤固有的异质性，目前 WHO 对胶质瘤的分类不足以表征不同的生存结果。即使有完善的分子标志物，胶质瘤患者的预后分层和治疗仍然是挑战。铁死亡与癌症的发展和进展有关，其在胶质瘤中的关键作用最近已被揭示（Liu et al., 2020）。在这种情况下，本研究旨在为胶质瘤建立一种新的与铁死亡相关的 lncRNA 特征。

我们的研究通过 WGCNA 确定了 30 个与肿瘤分级和微环境相关的铁死亡相关 lncRNA。利用 30 个中心 lncRNA，我们开发了用于预后预测的 lncRNA 特征。在两个独立队列中，与铁死亡相关的 lncRNA 特征在临床上与胶质瘤患者生存机会的不同分层相关。在多个时间点的不同数据集中存在强大的签名预测准确性。通过单变量和多变量回归，我们证明基于 lncRNA 特征的风险评分是调整临床因素后的独立预后指标。观察到包含年龄、肿瘤等级、放射治疗和风险评分的列线图在分类和预测性能方面都是准确的。更重要的是，观察到基于特征的分层与广泛的临床特征相关，包括肿瘤分级、MGMT 启动子甲基化状态、1p19q 共缺失状态和 IDH 突变状态。此外，在特征定义的高风险组中观察到免疫浸润增加，这导致了不利的生存结果。

铁死亡相关lncRNA特征共突出显示14个lncRNA，即APCDD1L-AS1、H19、LINC00205、LINC00346、LINC00475、LINC00484、LINC00601、LINC00664、LINC00886、LUCAT1、MIR155HG、NEAT1、PVT1和SNHG18。在 14 个 lncRNA 中，其中 8 个之前曾被报道过。据报道，H19 在高级别胶质瘤中上调，并促进了弥漫性内在脑桥胶质瘤的增殖（Roig-Carles 等人，2021）。LINC00346 通过靶向胶质瘤中的 ROCK1（ Chen 等人，2020 年）和 miR-128-3p/SZRD1 轴（Geng 等人，2020 年）促进细胞迁移、增殖和凋亡。在缺氧胶质瘤中观察到 LINC00475 的过表达，沉默 LINC00475 可抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭。于等人，2020a）。通过调节 miR-141-3p/YAP1 轴，LINC00475 促进了胶质瘤的肿瘤进展（Yu et al., 2020b）。LUCAT1 是胶质瘤中的一种致癌分子，其敲低可通过调节胶质瘤中的 miR-375 来抑制细胞活力和侵袭（Gao et al., 2018）。LncRNA miR155HG 有助于胶质母细胞瘤的肿瘤生长和进展（Wu et al., 2019），在之前的生物信息学分析中也发现了它的预后价值（Zheng et al., 2021）。NEAT1 被证明是胶质瘤细胞迁移、侵袭和肿瘤进展的促成因素（Chen 等人，2018 年；Zhou 等人，2018 年））。PVT1通过调控miR-128-3p/GREM1 Axis和BMP信号通路促进胶质瘤的肿瘤发生和癌症进展( Fu et al., 2018 )。SNHG18 的上调通过抑制 Semaphorin 5A 来促进胶质瘤对放射治疗的抵抗（Zheng et al., 2016）。与 LGG 相比，PVT1 和 SNHG18 在胶质母细胞瘤样本中的高表达在之前的研究中得到了验证（Zheng 等人，2021 年）。值得注意的是，lncRNA APCDD1L-AS1、LINC00205、LINC00484、LINC00601、LINC00664 和 LINC00886 的作用在本研究中首次报道和验证。

郑等人。（郑等人，2021) 建立了与神经胶质瘤中的免疫景观和放射治疗反应相关的预后铁死亡相关的 lncRNA 特征。然而，他们对三个队列应用了中位风险评分，每个队列中的分类为半对半，从而导致潜在的假阳性结果。值得注意的是，没有其他关于胶质瘤中铁死亡相关的 lncRNA 特征的报道。相比之下，本研究报告了与铁死亡相关的 lncRNA 特征，该特征在不同队列中具有相同截止值的胶质瘤患者的存活率表现出明显的分离。此外，还使用 qPCR 在高级和低级样本之间验证了铁死亡相关 lncRNA 特征的表达水平。它可以转化为临床环境，作为告知个体化预后的测试组。针对这些 lncRNA 的疗法有望提高疗效。然而，缺乏功能验证被认为是本研究的主要限制。lncRNA 的功能意义需要通过经验数据进一步验证。

结论

本研究建立了一个与铁死亡相关的 lncRNA 特征，可以有效地对胶质瘤患者的预后进行分层，对所有临床指标具有优越的预测性能。这些发现可能为开发用于胶质瘤预后和治疗的新型生物标志物铺平道路。