分子振荡器影响埃及棉夜蛾对杀虫剂的敏感性

 振荡器是生物钟的核心要素，是一种在分子水平上运行的机制，负责产生节奏。它由编码蛋白质的时钟基因产生，调节其自身和执行基因的表达。振荡器的活动表现在细胞、器官和整个机体的水平上，从而使生物体在最适当的时间执行生命功能。一个例子是当身体暴露在异种生物中时，排毒过程的强化。分子振荡器是生物钟的核心，由基因和蛋白质组成，其周期性表达在转录-翻译反馈环路（TTFLs）中受到调节。TTFLs的蛋白质既是其自身的调控者，也是参与控制昆虫许多过程的执行基因的调控者（例如，包括杀虫剂在内的异生物的节律性代谢）。

这篇研究的研究人员通过将时钟基因的dsRNA注入S. littoralis幼虫的体腔，并在连续光照下培养幼虫，从而破坏了S.littoralis幼虫的节律。结果，幼虫对杀虫剂的日常敏感度被取消，而在大多数情况下，敏感度也增加了（图 1）。在经过注射dsRNA处理的幼虫的脂肪体、中肠和马氏管（代谢异物的主要器官）中，参与解毒的酶--细胞色素P450单氧酶、谷胱甘肽-S-转移酶和酯酶的日常活动情况发生了明显变化。本研究的结果证明了分子振荡器在调节幼虫对杀虫剂的反应中的作用，并为合理使用这些化合物（在一天中的适当时间）提供了依据，并可能表明时钟基因是分子操纵的潜在目标，以基于RNAi方法生产植物保护化合物。 在一天中的正确时间实现每个有机体的重要功能是维持平衡的生理过程的有效过程的关键。这些过程旨在优化维持稳定状态所需的能量的使用，并通过有效运行的生物钟机制来完成。在众多依赖生物钟的过程中，那些与对生物体内不存在的、来自环境的化合物（外来生物）的反应有关的过程具有特别高的适应价值。事实证明，时钟功能的紊乱通过异物的低效代谢和排泄对身体产生了极大的破坏性影响，当异物以生物活性形式存在时，会威胁到许多器官和身体系统的平衡。这里介绍的结果是生物钟在最大限度地减少异物对机体的负面影响方面的作用的一个例子。这篇研究发现，如果S. littoralis幼虫的生物钟运行正常，它们对杀虫剂的敏感性就会降低。另一方面，如果我们通过暴露在恒定的光照下，破坏了幼虫的时钟（在这些条件下，蛾子的许多节律过程被取消），它们对最常用的杀虫剂的敏感性增加。当LD幼虫的LC50值最高时，在LL和LD中饲养的幼虫的易感性差异最大。考虑到LD条件下的幼虫对杀虫剂的敏感性（用LC50值的变化表示）在每天的节奏中波动，而在LL条件下的昆虫中，它在整个一天中保持在一个可比的水平，这一点是很明显的。在测试的三种杀虫剂--戊菊酯（拟除虫菊酯）、马拉硫磷（有机磷）和丙溴磷（氨基甲酸酯）的情况下，LD幼虫在夜间的LC50值明显高于白天的光照阶段；而氟虫腈（苯吡唑）、啶虫脒和吡虫啉（均为新烟碱类）应用于LD幼虫的LC50值在白天较高，在夜间较低。此外，就吡虫啉而言，在夜间的两个时间点，在LL饲养的昆虫的LC50值比LD高（图 2 ）。这表明，时钟功能紊乱不仅扰乱了对杀虫剂的日常反应，而且还可能导致对其中一些化合物的抗性增加。 

在个体或群体水平上观察昆虫对各种杀虫剂的昼夜敏感性和抗性，是一个研究的热点。蟑螂、甲虫、苍蝇和蛾类对不同毒物的敏感性的分子振荡模式已被报道，特别是针对20世纪60年代常用的杀虫剂，如DDT、狄氏剂和异狄氏剂（有机氯）、马拉硫磷、敌敌畏、对硫磷和谷硫磷（有机磷）、二甲胺（氨基甲酸酯）以及从植物中提取的除虫菊酯。分析表明，迁徙蝗虫幼虫对狄氏剂的易感性和抗性存在昼夜节律，在夜间投药时更容易受到这种杀虫剂的影响。同样，正如在我们的研究中一样，在恒定光照 (LL) 下饲养的黑腹果蝇的日常对残杀威的易感性节律被取消。然而，对这种杀虫剂的每日敏感性节律在黑腹果蝇中具有不同的特征。根据LC50分析，D. melanogaster在白天对残杀威的敏感性最低，而对 S. littoralis 的敏感性在晚上最低。在过去的十年中，关于对杀虫剂敏感性的日常变化的研究仍然是相关的。在蜜蜂Apis mellifera中显示了对戊唑醇、氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯（拟除虫菊酯）、吡丙醚（吡啶衍生物）、吡蚜酮（氨基甲酸酯）、二嗪农（有机磷）、茚虫威（有机氯）和特氟苯脲（苯甲酰尿素衍生物）敏感性的振荡。在这种情况下，幸存者的百分比在一天内发生了变化，这取决于它们中毒的时间和使用的杀虫剂类型。这反过来又类似于在S. littoralis身上观察到的关系，在那里，幼虫对个别杀虫剂的敏感性在一天中变化很大。有趣的是，棉蚜Aphis gossypii对二嗪农（有机磷）的敏感性在白天发生变化，与我们在用马拉硫磷（也是有机磷）处理的石南星中观察到的情况相似。此外，连续的照明也导致了蚜虫对二嗪农的LC50值的周期性变化的消失，正如马拉硫磷对S.littoralis的LC50值的情况。在S littoralis和B. mori中，对除虫菊酯的反应似乎是相似的。正如对S. littoralis所显示的那样，B. mori在下半夜对这些杀虫剂的敏感度最低，而在白天最高。蟋蟀，Acheta domesticus，在夜间也表现出对拟除虫菊酯ß-氰戊菊酯的最高抗性，表现为高存活率。当提出的结果也涉及到特定基因表达的分析时，上述的研究范围被大大扩展。编码一般的异生物代谢酶（特别是杀虫剂）的基因，重点是谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）和细胞色素P450单氧酶（P450s）家族，已被描述为在黄热病蚊子埃及伊蚊中有节律地表达。这种表达特性似乎与该物种不同的异生物敏感性的昼夜波动有关。                        

这项研究表明，研究的新路径可能以使用RNAi方法的可能性为标志，其中目标将是调节参与异物代谢的酶的系统元素，其活动是自然有节奏的。似乎扰乱编码调节因子的生物钟基因的表达可能是一个很好的工具，这些调节因子在调控异生物反应方面排名靠前（图 3）。用于控制对杀虫剂的敏感性的RNAi具有这样的优势：关闭个别成分的表达将导致许多从属代谢途径的功能障碍。因此，与目标是编码解毒酶的单一基因时相比，其作用是系统性的，也是更复杂的，这些基因经常被推测为使用RNAi技术的关键关闭目标。其中包括那些编码以我们所研究的活性为特征的酶，即P450、GST和酯酶。这篇论文的作者也遵循了这一推理，表明在用时钟基因的dsRNA处理的S. litura中，有可能关闭解毒基因的表达（然而，没有研究酶的活性）。正如文献所反映的那样，使用RNAi通过控制虫害来保护作物的兴趣很高，而且在不断增加。在这种情况下，拟议的目标是通常与发育和一般代谢有关的基因。在后者中，敲除这些参与灭活和清除体内异物的基因特别重要，因为它们正在形成昆虫对杀虫剂的敏感性。使用RNAi来增加昆虫对杀虫剂的敏感性也是合理的，例如，用于对这些化合物产生抗性的菌株。RNAi也被应用于抗性发展的研究中。 

在我们的研究中，我们表明，通过使用RNAi敲除时钟基因（从而编码影响转录的因子）来破坏分子振荡器的功能，有效地改变了专用器官中解毒酶的活性，但也影响了S. littoralis幼虫对我们测试的杀虫剂的敏感性（图 4 ）。从结果可以得出几个结论。首先，用per和cyc（几乎在一天中的每个时间点）和pdp1（在一天中的每个时间点）处理昆虫，明显降低了氟虫腈、马拉硫磷和丙溴磷的LC50。第二，在注射tim和cry2 dsRNA后的一天内，暴露于这些杀虫剂的昆虫的易感性（LC50）没有很大的变化。第三，在暴露于溴氰菊酯的昆虫中，dsRNA处理的效果主要是在对照组LC50值最高的时段（即夜间）几乎观察到。一个例外是施用pdp1dsRNA，它极大地降低了溴氰菊酯的LC50值，而不管其施用时间如何。第四，用编码TTFL负调节器的基因（per、tim和cry2）的dsRNA处理后，幼虫对新烟碱的反应相似，即与对照组幼虫相比，LC50值增加。然而，当使用TTFL中阳性调节器（cyc和pdp1）的dsRNA时，这些杀虫剂的LC50值下降或（较少且仅在cycdsRNA幼虫中）没有变化。生物钟基因代表了一个特殊的类别，因为当编码转录调控因子时，它们在生物体对有毒物质反应的级联中处于高度的位置。使用RNAi基因沉默技术，也证明了在这种层次系统中起作用的基因的重要作用，这些基因通过编码调节转录的因子，在解毒过程中对执行基因的控制方面有优势。然而，正如我们上面提到的，关于沉默时钟基因的表达与生理反应的变化（如对杀虫剂的敏感性差异）之间的关系的数据只有少数，而且来自对D. melanogaster突变体的研究，以及对S. litura和A.aegypti进行RNAi处理之后。这这个问题似乎非常有趣，而且面向未来，因为它使我们注意到合理使用杀虫剂的可能性，主要是根据一天中的不同时间来使用不同的剂量。另一方面，它将最大限度地减少它们的使用规模。

原文链接：https:// doi.org/10.3390/insects13050488