RAW264.7细胞的养技术攻略

RAW264.7细胞是一种非常重要的细胞系，因为它可以被用于炎症研究和细胞免疫学研究中。这篇文章将介绍怎样使用DMEM和胎牛血清（FBS）的培养基来培养RAW264.7细胞，以及如何进行细胞传代和保存。

1. 培养基制备

RAW264.7细胞最常用的培养基为DMEM，这是一种包含丰富营养和生长因子的培养基。添加FBS可以提供细胞生长所需的营养，起到刺激细胞增殖和防止凋亡的作用。

在制备培养基之前，要先准备好下列材料：

- DMEM培养基
- 胎牛血清（FBS）
- 靶标抗生素和抗生素混合物（如青霉素/链霉素）

制备步骤如下：

1）将DMEM培养基放入灭菌瓶中，并加入10%的FBS（即10ml FBS加入90ml DMEM），混合均匀后添加抗生素或抗生素混合物。

2）将制备好的培养基过滤灭菌，使用无菌针过滤器过滤，以避免细菌污染。

2. 细胞和培养条件

在培养RAW264.7细胞时，必须提供适合它们生长的环境以确保它们能够存活和繁殖。下面是RAW264.7细胞的培养条件：

- 培养温度：37°C
- CO2浓度：5%
- 恒温箱：生物安全柜或洁净室内

3. 培养细胞

在开始培养之前，请确保对实验器材进行消毒，以避免外部污染的影响。

3.1 细胞的解冻

1）使用1%的DMEM溶液将冰冻细胞冻存管均匀地加温到37°C；

2）将解冻细胞缓慢地加入到10ml的预先准备的DMEM/FBS培养基中，并缓慢摇晃，以避免产生气泡或过度搅拌。

3）在生物安全柜内将培养瓶放置在37℃/5% CO2孵化箱中，大约30-40分钟后细胞会开始连接在一起。

4）添加新的DMEM/FBS培养基以覆盖所有细胞，并将细胞放回37℃/5% CO2的培养箱中。

5）在24小时后再次将培养瓶检查一遍，检查培养瓶内的细胞有没有继续生长和分裂，如果发现有细胞正在死亡则需尽快更换培养基。

3.2 细胞的维护

RAW264.7细胞需要保持在恒温箱中生长，因为它们需要适宜的温度和环境，以便维持正常的生命活动。为此，我们要经常更换培养基，以确保细胞能够获得所需的营养和生长因子。

1）观察细胞生长状态：使用显微镜观察细胞是否生长繁殖，在维持恒定的温度和气体浓度，并更换培养基。

2）更换培养基：在培养箱内使用无菌技术更换新的培养基，要耐心地进行这项操作，并确保不产生气泡或其他污染。

3）细胞分化：生长至80%~90%π密度时，要将细胞进行传代，以保证活性和稳定性。

3.3 细胞传代

当整个细胞培养瓶表面覆盖了大量的细胞时，就需要将细胞进行传代（或称细胞分裂）。传代可以延长细胞的生命周期，并保持其形态及性质，同时也可以进行更多的实验。

以下是RAW264.7细胞传代的步骤：

1）收集尽可能多的细胞；

2）将胞体分散均匀：用1ml的10倍稀释液预先将细胞进行解聚，并将悬浮液使用移液器尽可能均匀涂抹在培养瓶中。

3）更换培养基：继续添加新培养基，更换后观察其生长情况。如果生长情况不佳，可以将培养瓶进行滚动、震荡或轻轻摇动，帮助细胞完全分散。

4）维持适宜的生长条件：细胞分散后维持培养箱中的37℃和5%的CO2浓度，观察细胞的生长状态。

5）更换培养基：每两天更换一次培养基，以维持细胞生长所需的营养和生长因子。

3.4 细胞保存

定期保存RAW264.7细胞可以帮助科学家实现长期或定期的实验需求。

以下是RAW264.7细胞保存的方法：

1）液氮冻存法：使用离心管收集细胞，加入1~2ml离心管中，用离心机旋转离心，除去超自由液。加入封闭的冻存管中，分别加入等体积的FBS和细胞液氮（-80℃）冻存，可以保存1~2年。

2）24小时内重分化法：使用无菌技术将RAW264.7细胞从原始培养并收集，使用新的解聚酶和培养基将细胞移植到新的培养瓶中，其中较早的几代可以保存一年。

在进行存储前，需确保使用严格的无菌技术，单次操作在一个专用的无菌生物安全柜中进行。同时，还需正确标注保存时间、细胞类型和编号，以确保使用时可以准确识别每个样品。

总之，RAW264.7细胞的培养需要遵循正确的实验操作规范，注重无菌技巧和对细胞的密集度和传代次数进行控制，以保证其稳定有效地进行实验。