Rho 激活剂 II的用途及生物活性检测说明
G-switch™系列小G蛋白工具系列的开发侧重于创建针对内源性Rho家族蛋白和信号通路的高效试剂。与依赖于过表达或敲降目标蛋白的方法（例如，DNA转染显性负性或常活性Rho突变体，RNAi敲降）相比，G-switch™试剂能够迅速作用于内源性目标蛋白（根据产品而定，时间范围为分钟至小时），从而优化产生更具生理学相关性的反应的机会。G-switch™产品系列包括直接和间接调节Rho家族信号传导的试剂，因此提供了广泛的机制工具来研究这些关键的细胞功能。请访问Cytoskeleton公司的网站获取最新的G-switch™信息。 CN03的活性位点基于细菌细胞毒性坏死因子（CNF）毒素的催化结构域。催化结构域与一种专有的细胞穿透基团共价结合。CN03通过脱氨酰胺化位于这些GTP酶的Switch II区域的谷氨酰胺-63来激活Rho GTP酶亚型（1）。这种修饰将谷氨酰胺-63转变为谷氨酸，从而阻断了固有和GAP刺激的GTP酶活性，导致Rho的常活性（2）。在添加到培养基后的2-4小时内，CN03显著增加了GTP结合的RhoA水平。此外，这种激活剂的有针对性作用使其比经典的间接激活剂（例如，LPA）更具吸引力，后者同时激活其他信号通路（例如，Ras、PI3K和PLC）。 艾美捷Rho 激活剂 II用途包括： Rho通路激活剂 研究Rho活化对细胞运动的影响 研究Rho活化对肌动蛋白细胞骨架重排的影响 研究 Rho 激活对与其他信号转导通路串扰的影响
材料： CN03是在细菌表达系统中制备的。重组蛋白的分子量为118 kDa，并在其氨基端含有六个组氨酸残基（His标签）。经过固定金属亲和层析（图1），已经纯化至80%以上的纯度。每个小瓶中提供的是白色冻干固体，含有20 µg的CN03蛋白。该物质已经在RhoA激活的生物学检测中显示出活性（见下文）。在RhoA激活的生物学检测中，一个包含单点突变的蛋白质失活突变体显示出零活性（未显示数据）。 储存和重溶： 在常温下运输。冻干的蛋白质可以在4°C下干燥储存6个月。CN03的冻干颗粒可能看起来松散且轻包装，但这不会影响CN03的质量或性能。为了重溶，简单离心以收集管底的产物，然后将每个小瓶中的产物重悬于200 µl无菌水中，放在冰上静置10分钟，轻轻上下吸移混匀，得到0.1 µg/µl的浓度。在使用之前，CN03应进一步与无血清培养基稀释至0.25至5 µg/ml的浓度（由用户确定，参见图2和表1）。通常，在3小时内，1 µg/ml的浓度能够在多种细胞类型中产生强大的RhoA激活。重溶的激活剂可以在液氮中快速冷冻，并在–70°C下储存长达6个月。 Rho 激活剂 II生物活性检测： 在37°C孵育2小时后，CN03（1 µg/ml / 相当于10 µl/ml）显示出在瑞士3T3细胞中引发了十倍的RhoA激活（图2和图3）和应力纤维诱导（图4）。在表1中详细介绍了在几种细胞类型中激活Rho的推荐条件。 活性检测方法：瑞士3T3细胞激活 1. 在两个含有10 ml DMEM / 10%胎牛血清（FBS）的10 cm²培养皿中，将瑞士3T3细胞以37°C / 5% CO2培养至30%的密度。 2. 将培养基更换为DMEM / 1% FBS，饥饿细胞24小时，然后转移到DMEM / 0% FBS培养24小时。 3. 简要离心CN03管，使其沉淀在管底。 4. 用200 µl无菌水（0.1 µg/µl）重溶CN03-请参见上面的储存和重溶部分。 5. 用温暖的DMEM将CN03稀释至1 µg/ml。 6. 吸去培养皿中的培养基，将含有CN03的培养基转移到一个培养皿中。 7. 只向第二个培养皿中加入温暖的DMEM。这是对照组，代表未刺激的细胞。 8. 在37°C和5% CO2下孵育2小时。通过G-LISA®分析（Cat. # BK124；图2和图3）或细胞形态学（Cat. # PHDG1；图4）来检测Rho活性。
Rho 激活剂 II文献参考： 1. Schmidt G., et al. 1997. Gln 63 of Rho is deamidated by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1. Nature. 387, 725-729. 2. Flatau G., et al. 1997. Toxin-induced activation of the G protein p21 Rho by deamidation of glutamine. Nature. 387, 729-733.
