基因编辑服务

CRISPR/Cas9核酸酶可以形成特定序列的双链DNA断裂（DSB）。当细胞使用非同源末端连接（NHEJ）途径修复这些基因时，会产生小的插入或删除突变（indels）并扰乱基因。或者，DSB可以通过同源重组修复途径（HDR）特异性改变碱基，或者可以使用donor vector来形成基因插入。由于CRISPR/Cas9易于构建和在人细胞中的毒性较低，在基因编辑中备受青睐。然而，由于iPSC不像普通肿瘤细胞系那样具有总染色体异常和异常强烈的DNA损伤反应的特点，基因编辑在人类iPSC中成功率更低。CRISPR-U™采用了最大化基因组编辑效率的策略，我们在人类iPSCs中获得的基因切割效率和同源重组效率比传统方法提高10倍。

基因敲除

CRISPR-U™基因敲除iPSC细胞通过核转染法将gRNA和Cas9转入iPSC细胞中，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。

应用案例

人T-iPSC分化的CD8αβ细胞在CD4/CD8双阳性分化过程中，通过T细胞受体（TCR）α链的重排而失去抗原特异性。使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重组酶基因（RAG2）阻止了这种额外的TCR重排。含有稳定的TCR的CD8αβ-T细胞在异种移植肿瘤模型能有效地抑制肿瘤生长。这些方法有助于安全有效的T细胞免疫治疗。

参考文献：

Minagawa, Atsutaka, et al. "Enhancing T cellreceptor stability in rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer immunotherapy." Cell Stem Cell 23.6 (2018): 850-858.

基因点突变

CRISPR-U™基因点突变iPSC细胞

通过核转染法将gRNA载体（含Cas9）和Donor共转入细胞中，gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，iPSC细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR），将目标点突变重组到基因组靶位点。

gRNA载体携带抗性，可进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出点突变纯合的阳性克隆。

 · 细胞疾病模型建模

通过HDR，携带点突变序列的donor oligo (ssODN)替换WT对应的碱基。

·  细胞疾病模型修复

通过HDR，携带WT序列的donor oligo (ssODN)替换对应的突变碱基。

应用案例：

PSEN1基因A79V突变可引起阿尔茨海默症。研究表明，将阿尔茨海默症患者的体细胞诱导为多能干细胞（iPSC），然后通过用野生型序列替换点突变序列，修正突变的基因。通过研究患者的iPSC和修正后的iPSC，可以得知该突变对细胞表型的影响，从而深入研究该突变的病理性作用。

用于修复A79V-hiPSC点突变的gRNA序列和ssODN。

·  A 突变位点附近的基因组序列：红色的T是需要被修正的核苷酸；黄色的是sgRNA识别位点，加粗的AA是Cas9的切割位点；粉红色的是正反向引物。

·  B Donor oligo序列, 绿色的C是修正后的核苷酸。

iPSC中PSEN1基因的序列分析。

·  A 点突变修正后的杂合子测序结果。

·  B 点突变修正后的纯合子测序结果（T>C）。

参考文献：

Pires, C., Schmid, B., Petræus, C., Poon, A., Nimsanor, N., Nielsen, T. T., ... & Freude, K. K. (2016). Generation of a gene-corrected isogenic control cell line from an Alzheimer's disease patient iPSC line carrying a A79V mutation in PSEN1. Stem cell research, 17(2), 285-288.

来源 | 源井生物

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