如何用SV40大T抗原永生大鼠腹侧间脑NPCs？

研究课题 

如何用SV40大T抗原永生大鼠腹侧间脑NPCs

今天推荐的是由汉诺威医学院神经解剖研究所在2010年2月23日发表于Cell and Tissue Research（2021IF：3.5999，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Claudia Grothe教授，研究表明用SV40大T抗原永生化的大鼠腹侧间脑神经元祖细胞的特征和分化潜能。

研究背景

神经元祖细胞（NPC）在再生医学中具有很大的应用潜力。为了克服其有限的有丝分裂能力，人们采用了各种永生化策略，使其能够在体外长期保持和扩增。这种永生化细胞可用于设计和发现治疗神经退行性疾病（如帕金森病）的新细胞疗法。

摘要部分

研究人员利用SV40大T抗原（SV40Tag）永生了大鼠腹侧间脑NPCs。与原代细胞相比，所有克隆细胞的增殖率都高出两到三倍。为了诱导所生成细胞克隆的多巴胺能分化，应用了胶质源性神经营养因子和二丁烯环磷酸腺苷。然后对处理过的细胞进行表征，包括多巴胺能系标志物的表达、各种细胞群的分化、在凯因酸盐存在下的钙成像以及叶内移植后的免疫组化。经处理的细胞显示出形态成熟，钙成像显示出在凯氏酸盐存在下的神经元特性。这些细胞还表达了低水平的多巴胺转运体和酪氨酸羟化酶（TH）mRNA，但没有发现TH免疫阳性神经元。将神经细胞移植到神经毒素缺失的大鼠体内并不能诱导其进一步分化。作为一种替代方法，研究人员用si RNA沉默了SV40Tag，但这并不足以引发多巴胺能神经元的分化。不过，从β-tubulin III型和胶质纤维酸性蛋白染色中可以分别检测到神经元和胶质细胞。SV40Tag细胞适用于进行可控的基因修饰，这体现在高效的非病毒转染后过表达了增强的绿色荧光蛋白。

材料方法

1. 永生化大鼠VM-NPC克隆的生成和表征。

按照Timmer等人的方法培养从E12大鼠胚胎中制备的VM祖细胞。在增殖条件下培养3天后，用pSV3-neo核转染细胞以表达SV40Tag。在G418选择条件下培养2周后，通过稀释获得克隆。从四个SV40Tag细胞克隆（C1、C2、C3和C4）中分离出的细胞DNA显示，除了高分子基因组DNA外，还有两条从成年大鼠中分离出的对照基因组DNA制备中不存在的条带。由于这些条带的大小比pSV3-neo质粒小得多，因此这些条带很可能是重组质粒。这种染色体外复制的DNA以前在用pSV3-neo质粒转染的细胞中也有报道。通过定量PCR将细胞DNA数量与单拷贝基因BDNF进行归一化，发现C1、C2和C4株系中SV40Tag序列的数量相似，而C3株系中SV40Tag序列的数量仅为C1、C2和C4株系的一半。半定量RT-PCR显示SV40Tag mRNA的表达水平相似（图1a），Western印迹分析显示所有四个细胞克隆中都存在SV40Tag蛋白（90kDA）（图1b）。此外，免疫细胞化学染色法在体外永生化细胞克隆的培养液中（图1，c'-f'）和移植到帕金森大鼠模型体内后检测到了SV40Tag。在成功生成各种SV40Tag细胞克隆后，研究人员接下来检测了它们的增殖活性。研究人员使用WST-1试验评估了倍增时间。与原代VME12细胞相比，所有分析的细胞克隆的倍增时间都缩短了两到三倍（图2a）。永生化细胞克隆的倍增时间在13到18小时之间，而原代E12细胞的倍增时间为47小时。

利用半定量RT-PCR对转录因子和其他与DA分化相关的分子（表1）进行了表征。在增殖和分化条件下对原代间脑培养物和永生化细胞克隆进行了分析。在增殖条件下观察2天和4天后，在分化条件下观察2天和5天后，可观察到原始间脑祖细胞的特征图谱（图2b），包括Pax2、Lmx1b、Wnt1、Wnt5a、Nurr1、Dlk1、En1、Pitx3、Ngn2、DAT和TH的表达。在分化条件下，可以看到原代细胞中Pitx3、DAT和TH等末端标志物的表达水平升高（图2b）。接下来，研究人员分析了经过短期培养（在粘附培养基中培养1天，在分化培养基中培养3天）后永生化的SV40Tag克隆。关于参与向DA神经元规范化和早期分化的基因，四个克隆中有三个（C2、C3和C4）显示出与原代VM培养物相似的特征（图2c），如Lmx1b、Wnt1、Wnt5a、Nurr1、En1和Dlk1的表达。然而，既没有检测到Ngn2的表达，也没有检测到Pitx3、TH和DAT等终末分化标记物的表达（数据未显示）。仅在C1和C3中观察到Pax2的表达。在这些条件下，细胞在形态上仍处于未分化状态，免疫细胞化学也证明了这一点，免疫细胞化学既没有发现神经元细胞（β-tubulinIII型），也没有发现胶质细胞（GFAP），而所有细胞都有nestin免疫反应（图1c-f）。

▲图1.在生成的细胞克隆。

▲图2.对生成的SV40Tag-immortalized细胞克隆进行表征

研究结论：永生化大鼠VM-NPC克隆的生成和表征，SV40Tag间脑细胞克隆表达DA神经元规格化和早期分化的标志物。

2. 间脑细胞克隆的分化潜能。

诱导所选克隆进一步分化的第一种尝试是引入编码SV40TagshRNA的载体，以实现对SV40Tag表达的沉默。只有一个细胞克隆（C1）在嘌呤霉素选择下转染6天后，通过Western印迹和免疫细胞化学检测SV40Tag，成功实现了沉默（图3a-c）。在适合原代祖细胞的分化培养基中培养未能触发DA分化（即TH免疫反应，数据未显示）。然而，随着时间的推移，沉默导致C1中的β-微管蛋白III型细胞数量增加（图3d、f），并且在这些条件下发生了神经胶质分化，因为12天后发现了具有GFAP免疫活性的细胞（图3e）。此外，研究人员还可以观察到一些细胞中的nestin免疫活性下降（图3g，箭头）。第二种分化方法是将永生化细胞克隆（C2和C3）在cAMP和GDNF存在下培养12天。经nestin免疫染色（图4c-f）和相位对比分析（图4a、b）后，观察到cAMP/GDNF处理细胞与未处理细胞的形态差异，特别是神经元的生长。只有在cAMP和GDNF处理的细胞中才发现了神经元的进一步分化（以β-微管蛋白III型免疫反应为标志）（图4g、h、g'、h'）。有趣的是，通过评估涉及DA神经发生的各种基因的表达，发现一个细胞克隆（C2）显示出与原代祖细胞相似的表达模式，包括在这些条件下Pitx3、DAT和TH的表达（图4i）。将分化3天后C2和C3的表达谱（图2c）与分化12天后的表达谱（图4i）进行比较，还观察到其他差异。分化3天后在C3中检测到的Pax2表达在分化12天后消失。相反，3天后在任何细胞克隆中都未检测到Ngn2的表达（数据未显示）；但在分化12天后，在C2和C3克隆中都观察到了Ngn2的表达，在cAMP/GDNF处理的培养物中，Ngn2的表达水平升高（图4i）。其他尝试，如两种方法（SV40沉默和cAMP/GDNF处理）的结合或应用更高浓度的FCS或不同量的Forskolin和BDNF，都没有导致SV40Tag细胞的DA分化。

使用Fura-2荧光钙成像技术检测cAMP和GDNF处理的C2细胞中的钙瞬态。该方法用于获取神经元分化及其时间过程的功能信息。第一步，用不含激动剂的细胞外溶液进行记录，检测细胞内钙浓度的自发瞬态，作为钙渗透性突触谷氨酸受体（即神经元分化的标志）表达的功能相关性，并追踪突触接触的建立。研究人员没有在这些NPC中检测到自发出现的细胞内钙信号。然而，对离子型α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸（AMPA）/KA-型谷氨酸受体施加100μMKA（一种非脱敏激动剂）2秒脉冲后，可再现钙瞬态，细胞内钙平均增加（75.45±5.46 nM，图4j）。细胞外钙（3.2 mM）是出现这种钙信号的先决条件。因此，可以推测钙流入了记录的NPC。钙浓度在2.3±0.41秒内衰减至峰值的1/3。所有记录到的钙瞬态点都能完全衰减至基线，这表明细胞具有足够的钙缓冲能力。这些数据揭示了KA调节的钙离子渗透谷氨酸受体的膜表达。

▲图3.用编码SV40Tag shRNA的质粒pSUPER.puro转染可抑制SV40免疫反应

▲图4.应用cAMP和GDNF后的分化

研究结论：进一步研究了细胞克隆在两种不同条件下的分化潜能。

3. 鉴定脑室内移植后的SV40Tag-immortalized细胞。

将SV40Tag克隆C1和C2移植到6-OHDA病损大鼠脑内后，对冠状脑切片进行SV40Tag抗原、神经元和胶质细胞标记物以及nestin表达的免疫组织化学分析。克隆1转染后在粘附培养基中培养1天，在分化培养基中培养4天。将1 μl中含有200,000个细胞的4个沉积物分别移植到6-OHDA病变大鼠的纹状体中。移植后7天，移植物中发现SV40免疫反应（图5a、b）。进一步的免疫组化分析显示，移植体中存在巢蛋白和GFAP阳性的细胞群（图5c、e）。移植体中GFAP免疫反应阳性细胞的数量相对较少（图5c、e，箭头），这与体外研究获得的数据一致。与移植物周围的GFAP和nestin标记细胞相比，这些细胞显示出不同的形态；它们很可能是宿主组织形成的胶质瘢痕中的反应性星形胶质细胞（图5e）。此外，在移植物内还发现了对β-微管蛋白III型呈阳性反应的神经元（图5g）；但没有检测到TH免疫反应细胞（数据未显示）。虽然C2细胞在体外经过12天的cAMP/GDNF处理后可诱导神经元分化，但将这些细胞移植到神经毒素缺损的大鼠体内并没有增加移植物内的神经元数量（数据未显示）。

▲图5.鉴定SV40Tag-immortalized细胞产后移植。

研究结论：鉴定了SV40Tag-immortalized细胞的产后移植。

4. 将基因高效转入SV40Tag-immortalized间脑细胞。

用pCAGGS-EGFP表达载体核转染和/或脂质体转染法转染原代和SV40Tag-immortalized间脑细胞。为了估算两种方法的转染效率，计算了EGFP荧光细胞数与DAPI阳性细胞数的比率（图6a、b）。值得注意的是，这两种方法对永生化细胞的转染效率相似，都约为60%，而原代细胞的核转染效率为47%（图6c）。

此外，如初步实验所示，SV40Tag细胞单层适合与原代祖细胞（分化条件下分化前5天的E12VM细胞）进行共培养实验（图7）。分化成DA神经元（TH阳性）的原代细胞成簇分布（图7a、b）。有趣的是，神经球内没有SV40Tag阳性细胞（图7c，d）。

▲图6.将基因高效转移到SV40Tag-immortalizedVM细胞中

▲图7.原代VM与SV40Tag-immortalized细胞的共培养

研究结论：将基因高效转入SV40Tag-immortalized间脑细胞

结论与讨论

总之，尽管生产用于实验和治疗的持久性DA神经元来源的目标尚未实现，但这些永生化细胞克隆的实验证明了它们的多能特性，因为这些细胞（1）在特定条件下可分化为神经细胞和胶质细胞类型，分别显示出GFAP和β-微管蛋白III型免疫反应；(2)表达涉及DA神经元神经发生的关键基因的mRNA；(3)表达钙离子渗透性AMPA受体，调节完整的细胞内稳态，因此能够经历进一步的发育过程。此外，所生成的细胞克隆可用作研究DA表型的规格化和分化过程中发生的分子事件的模型，也可用于进行受控遗传修饰，包括神经营养因子、神经递质或其他与DA细胞分化、维持和功能相关的活性化合物的过度表达。最后，本报告为研究体外VM多巴胺能神经元发育和生理学的永生化方法的文献增添了有用的信息。