药物致肾小管间质纤维化动物模型【免疫荧光代做】

药物致肾小管间质纤维化动物模型【免疫荧光代做】

【造模机制】腺嘌呤体内氯化物 2,8—二羟基腺嘌呤以不溶性结晶的形式大量沉积于肾小管,造成肾小管部分扩张,部分变性坏死,间质淋巴和单核细胞浸润,病变晚期可见2,8—二羟基腺嘌呤结晶周围大量肉芽肿样增生结节形成,肾间质广泛纤维化。

【造模方法】

1.动物和器材、试剂选用 Wistar 雄性大鼠,体重 150～200g,适应环境 1 周后,随机分组。分笼饲养,自由饮食。造模前将腺嘌呤(adenine,为上海丽珠东风生物技术有限公司产品)以 2%淀粉溶液溶解,制成混悬液。

2.模型制备模型组以 150mg/kg 腺嘌呤混悬液灌胃,对照组以腺嘌呤相同体积淀粉落液灌胃。每日灌胃 1次,连续 17周。3.样本采集和指标测定分别于第 3 周、第 7 周、第 12 周、第 17 周四个时间点收获动物样本,进行功能学,组织学,免疫组化检测与观察。

(1)功能学检查:将动物置于代谢笼收集 24 小时尿液,采用考马斯亮蓝法在 UV755B分光光度计上比色测定 24 小时尿蛋白含量;利用底物法在 UV755B 分光光度计测定尿中尿N-乙酰丹-葡萄糖苷酶(NAG 酶)。分别在上述时间点从眶静脉丛取静脉血,采用 Beck-man CX-7 全自动生化分析仪测定血清中 Ser和 BUN。

(2)组织学观察:实验第7周、第 12 周、第 17 周分别收获动物各 10 只。取肾组织置于10%多聚甲醛中固定 24 小时,常规梯度酒精脱水,二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋,3pl 切片,行 HE常规染色和 Masson 特染。光镜下在 IDA-2000 高清晰度数码显微图像分析系统下计算肾间质纤维化指数。高倍镜(×200)下随机选取 10 个不重叠视野测定间质纤维化而积与同视野小管间质总面积的百分比。免疫组化实验各组肾组织常规10%甲醛固定,石蜡包埋,3μl 切片,多聚L 赖氨酸处理过的载玻片贴片,58℃下烤片。利用 SABC试剂盒进行免疫组化染色。

【模型特点】

1.病变典型,时相性强造模 1～3 周模型组大鼠可见 2,8—二羟基腺嘌呤结晶明显,多位于近曲小管管腔内。受累肾小管上游各段扩张,上皮细胞变性、坏死,间质弥漫淋巴和单核细胞浸润。病变第 4～7 周,各级肾小管弥漫扩张,上皮细胞萎缩和再生明显,2.8—二羟基腺嘌呤结晶沉积处单核吞噬细胞及大量成纤维细胞增生。可见 2,8—二羟基腺嘌呤结晶周围单核吞噬细胞增生的结节状病变广泛形成。第 12 周时,肾小管上皮空泡或颗粒性变性,局灶性小管扩张明显,基底膜断裂,小管间质区域增宽,纤维化明显。至第 17 周时,可见肾小管明显萎缩及消失,伴代偿性扩张,间质广泛纤维化。发生发展有规律性,随着病情进展肾功能持续恶化;小管间质损伤由早期的间质淋巴细胞和单核细胞浸润,肾小管上皮细胞变性、脱落,小管扩张上皮细胞萎缩或再生逐渐进展到肾小管明显萎缩及消失,小管代偿性扩张,间质广泛性纤维化。

2.可控性好,成功率近 100%通过严格控制腺嘌呤的给药剂量,在加快病变进程的同时,可通过给药量的适当变化控制动物模型的发展,使 TIF 模型复制的成功率接近100%。

【应用范围】研究肾小管间质纤维化肾病的发生发展规律和发病机制。研究肾小管间质纤维化过程中,肾小管上皮细胞是否发生表型转化以及骨形态发生蛋白-7 的表达。

【注意事项】

1.病理组织学观察要突出重点和动态性观察应重点观察腺嘌呤体内氧化物 2.8—二羟基腺嘌呤以不溶性结晶的形式大量沉积于肾小管,从而使肾小管扩张,变性坏死,间质细胞浸润,增生结节形成,肾间质广泛纤维化。应抓住这一主线进行动态观察。

2.腺嘌呤给药剂量和方法是造模成功的关键由于腺嘌呤水溶性极低,故传统给药方法多将腺嘌呤摻人固体饲料中随机饲喂,但不同动物的实际药物摄入量差异较大,因此,个体间存在显著的病变差异。本模型建立的过程中对给药途径进行了改良,即将腺嘌呤加入2%的淀粉溶液中,加热制成腺嘌呤淀粉混悬液给动物灌胃。这样可严格控制给药剂量。

【模型评估】 TIF 临床病程漫长,病因复杂,加上取材的局限性,对其病理过程进行动态研究比较困难,因此典型而稳定的动物模型是研究 TIF 的重要手段。常见 TIF 实验模型建立方法包括药物诱导、免疫介导、肾次全切除、单侧尿路阻塞、放射损伤等方法,但均有各种的弊端,难以获得稳定的结果。腺嘌呤 TIF 模型病变典型而稳定,改进了给药方法,造模成功率近 100％,是研究 TIF 病理机制很好的动物模型。

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