WB（Western Blot）：即蛋白质免疫印迹，是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来的一项检测蛋白质的技术，它结合了SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白的高分辨率及抗原抗体反应的特异性。

WB的特点：

•       利用抗原抗体的特异性反应完成检测，结果更可靠；

•       可以做内部参照（加入内参），分析更方便；

•       可以分辨出相同分子量大小的目标表蛋白；

典型的印记实验包括3个步骤：

•       蛋白质的电泳分离

•       电泳后凝胶上的蛋白质转移到膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域

•       免疫学检测

WB ——常规样品处理

常用裂解液类型

Ø  贴壁/悬浮细胞

•       收集细胞

取生长状态良好的细胞，轻轻倒掉培养瓶中的培养基；

加2ml预冷的PBS，洗2次，去掉死细胞；

加入胰酶消化细胞；

加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液，离心收集细胞沉淀；（悬浮细胞直接离心收集细胞沉淀，不需要消化）

PBS漂洗，离心，重复两遍，洗掉残余培养基，弃倒残余的PBS，只留细胞沉淀（可冻存于-80后一起提蛋白）

•       裂解

取上一步收集的细胞沉淀；

加入RIPA（强）裂解液，裂解液需要提前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1：100）；

冰上裂解10—20min；

•       收集样品

裂解好之后，4℃，高速离心，12000rpm/10min；

收集上清，转移至1.5ml EP管中，整个过程需在冰上进行；

分装保存于-20℃或者-80℃中备用；

Ø  肿瘤组织样品

•       匀浆机（上海净信全自动样品快速研磨仪）

取小鼠肿瘤组织，纯水冲洗，吸水纸吸掉多余水分；

剪刀剪取30mg组织样品；每管加入300ul RIPA强裂解液，加入3ul蛋白酶抑制剂（1：100的比例加入），加入2颗钢珠；

匀浆仪匀浆，65HZ，30s，匀浆2次后，冰上裂解30min；

弃掉钢珠，4℃，12000rpm/10min高速离心；

收集上清，转移至1.5ml EP管中，整个过程需在冰上进行；

分装保存于-20℃或者-80℃中备用；

•       超声破碎仪

取小鼠肿瘤组织，纯水冲洗，吸水纸吸掉多余水分；

剪刀剪取30mg组织样品；每管加入300ul RIPA强裂解液，加入3ul蛋白酶抑制剂（1：100的比例加入）；

超声破碎仪破碎，10-15s，超声频率是30%-40%，重复3次（期间每次间隔10s），冰上裂解10-30min；（样品之间，探头需要冲洗）

4℃，12000rpm/10min高速离心；

收集上清，转移至1.5ml EP管中，整个过程需在冰上进行；

分装保存于-20℃或者-80℃中备用；

WB —— 蛋白定量

常用的蛋白定量方法对比

提取的样品中若含有去垢剂则需要选用BCA法进行蛋白浓度测定，若样品中含有螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类等，则需要选用Bradford法进行蛋白浓度测定。

•       BCA法蛋白定量（雅酶试剂盒，ZJ101，实验室在用的）

取试剂盒中最大浓度8号，以PBS进行2倍连续稀释，稀释6个点（第一孔为标准品原液，10ul标准品+10ulPBS稀释），最后一个点为PBS阴性对照，加入到96孔板中；

蛋白样品按照10倍稀释，取2ul蛋白样品+18ulPBS，加入到96孔板中；

按照试剂盒说明书配制显色液，充分混匀，每孔加显色液200ul；

37度孵育30min；

酶标仪562nm检测OD值；

蛋白样品浓度归一化（有模板，有需要私信或评论）

WB —— 蛋白变性（加热）

金属浴95°C-100°C，加热5-10min，加热使样品变性（若加热10min仍然粘稠可适当补加SDS-Loading buffer；煮蛋白时间不能太长，会产生蛋白交联或降解）；

煮沸变性后的蛋白应立刻置于冰上降温，防止蛋白聚集复性；

膜蛋白，多重跨膜蛋白的变性：70℃ 加热10分钟（煮沸可能会使膜蛋白发生聚合）；

样品短期可保存在-20°C，长期保存在-80°C；

WB —— SDS-PAGE电泳

上样规格：0.1mm/15孔梳子，上样10ul，总量15ug;

SDS-PAGE（自己配制，碧云天的试剂盒，P0012A）：上样前可用针管吹一吹，避免气泡和多余凝胶堵塞上样孔，以免样品溢出到电泳缓冲液中；

上样前蛋白处理：上样的蛋白样品95-100℃加热5min，12000rpm离心5min（冻存样品会有SDS沉淀析出，影响跑胶结果），吸取上清上样；一般1mm/15孔的梳子，上样10ul；为了区分加样的顺序，marker可一边加5ul，一边加2-3ul；

SDS-PAGE Running Buffer：一般是买的10X的成品buffer，纯水稀释至1X后使用；

SDS-PAGE电泳条件：一般以小电压80-100V起跑，10-15min，样品会跑到一条平齐的线上，marker可看到条带时（即样品跑入分离胶中），再加大电压换120V/50-60min；

WB —— SDS-PAGE转膜

转膜缓冲液的配制（现配现用，电泳跑到分离胶就可以配制了）：

1L体系：3.03g的Tris；14.4g的甘氨酸；200mL甲醇；纯水定容至1L，充分搅拌均匀，放入制冰机或者-20℃提前预冷；

转膜条件：湿转，200V/90min，若蛋白过大，可适当延长；

实验步骤：

换用干净手套，取PVDF膜，并剪至合适大小，放于甲醇中浸泡数十秒（甲醇可活化PVDF膜上面的正电基团，使它更易跟带负电荷的蛋白质结合）

将提前预冷的转膜缓冲液倒入盘中；

准备转膜三明治夹，海绵，滤纸，浸湿备用；

取出电泳完的玻璃板，撬去玻板（动作要轻，上下都需要撬），切掉上下多余的部分，借助转膜缓冲液轻轻松动凝胶，放入转膜缓冲液中备用；

平放转膜转移槽，依次在黑色面叠放海绵，3张浸泡过的滤纸（按照滤纸的厚度进行增减），凝胶，PVDF膜（为了区分，可减角进行标识），每叠放一层，都需要赶走气泡，红面上叠放海绵，3张浸泡过的滤纸；

夹紧后，放入转膜槽，黑板对黑板；

转膜槽内两侧可放冰袋，外侧可用冰水混合物+冰袋包围，降低温度（转膜过程中，会发热，避免膜被烧干）

设置转膜条件，200V/90min；

WB —— 封闭

试剂配制（转膜开始之后就可以配）

1XPBST（0.02%）：1L PBS+2mL Tween 20，充分混匀后室温存放；

5%的脱脂奶粉（现配现用）：称量2.5g脱脂奶粉到1XPBST中，充分涡旋混匀，4℃保存备用；

封闭：取出转膜成功的PVDF膜，放置于5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h；

（封闭的作用：用大分子物质封闭非相关的蛋白结合位点，降低抗体与膜的特异性吸附，降低背景，Tween 20的作用也是减少非特异性吸附）

WB —— 一抗孵育

封闭完成后，即可开始孵一抗；

参考一抗的说明书，按照适当比例稀释一抗，一般1：1000稀释，用含5%脱脂牛奶的PBST进行配制（注意样品和抗体的种属需要匹配）；

根据实验所需要检测的蛋白大小，将膜进行切割（可将膜放入PE手套，加一点封闭液，用尺子比着marker，用切胶的小刀切膜），并将膜的一角切除或者标记笔标记进行区分；

将稀释好的一抗加入到孵育的盒子里，放入对应切好的条带，4度摇床过夜孵育；

内参根据实验目的进行选择，一般是β-actin，GAPDH抗体，1：10000进行稀释，具体的参照实验室买的抗体的说明书；

孵育完的一抗可进行回收，一般可重复利用5-10次；

WB —— 二抗孵育

回收一抗；

将孵育过一抗的膜夹到洗膜的容器里（我们实验室常用的是96孔板的壳子），加入1X PBST，一般洗3次，每次5min（如果有实验耽搁，洗久一点也没关系）；

用1X PBST配制二抗，参照说明书，注意种属，一般是1：10000稀释，室温下摇床孵育1h;

将孵育过二抗的膜夹到洗膜的容器里（我们实验室常用的是96孔板的壳子），加入1X PBST，一般洗3次，每次5min（如果有实验耽搁，洗久一点也没关系）；

WB —— 化学发光

在实验台上铺一张PE手套，将PVDF膜放在PE手套上；

将ECL的A液和B液在EP管内等体积混合，均匀滴在PVDF膜的蛋白面，反应2-5min；

在照胶仪内铺一张PE手套；

取孵育好的PVDF膜，吸干多余的ECL工作液，将膜放到PE手套上；

照胶仪曝片，保存，数据分析；