Establishment of a Risk Signature Based on m6A RNA Methylation Regulators That Predicts Poor Prognosis in Renal Cell Carcinoma

Abstract

目的

N6-甲基腺苷 (m6A) 修饰是最常见的甲基化修饰之一，它们由 m6A RNA 甲基化调节因子介导。然而，它们在肾细胞癌 (RCC) 中的作用尚不完全清楚。本研究的目的是调查监管机构对 RCC 的影响。

材料和方法

检测 RCC 中 13 个主要 m6A RNA 甲基化调节因子的表达水平，并进行共识聚类以探索它们与 RCC 的关系。此后，建立了基于监管机构的风险签名。通过使用两个数据集（癌症基因组图谱 [TCGA] 和基因表达综合 [GEO] 数据集）和 ROC 曲线分析进行预后分析，该风险模型得到了充分验证。

结果

与 TCGA 数据库中的 128 名正常对照相比，在 13 种主要 m6A 调节剂中，893 例 RCC 病例中有 6 种显着上调，4 种显着下调。基于监管机构的共识聚类确定了两个 RCC 病例集群，它们与病理特征（T 状态）显着相关。因此，这些结果表明 m6A RNA 甲基化调节因子与 RCC 相关。此后，建立了涉及两个监管机构（METTL14 和 WTAP）的风险模型。基于人类蛋白质图谱数据和 RCC 和正常细胞系中的实时 PCR 进一步证实了这两种调节剂的 mRNA 和蛋白质表达水平的变化。结果表明，风险模型可以作为总生存期的独立预后标志物，

结论

总的来说，本研究的结果表明风险模型（基于两个 m6A RNA 甲基化调节因子）可以作为 RCC 的独立预后指标，这可能有助于进一步研究 RCC 中的 m6A RNA 修饰。

关键词：肾细胞癌，m6A甲基化，TCGA，预后特征

结果

m6A RNA 甲基化调节因子在 RCC 中的表达

m6A RNA 甲基化调节因子在各种肿瘤的形成和发展中起关键作用。首先，这些调节剂的表达水平（表格1) 比较了从 TCGA 数据库中获得的 893 个 RCC 和 128 个正常组织。在 13 个基因中，有 10 个基因表现出显着差异。与正常对照相比，RCC 患者的 6 个基因（METTL3、RBM15、YTHDF1、YTHDC2、ALKBH5 和 FTO）显着上调，4 个基因（METTL14、ZC3H13、HNRNPC 和 YTHDF2）显着下调。图 1A和和 B)。乙）。此外，13 个调节因子的表达水平呈正相关（图 1C）。

通过共识聚类分析识别两个 RCC 病例集群

ConsensusClusterPlus 软件包用于根据 TCGA 数据库中 893 个 RCC 组织中 13 个 m6A RNA 甲基化调节因子的表达水平进行共识聚类分析。结果表明，当k=3时，累积分布函数（CDF）曲线下面积的相对变化明显减小（图 2A和和 B)。乙）。然而，共识矩阵表明，当将病例分为三个集群时，集群之间存在相当大的分类重叠。因此，案件被分为两组（图 2C）。对于 k = 2-9，RCC 病例的分布呈现在图 2D. 两个聚类的主成分分析用于评估分类的性能。结果表明，集群 1 病例聚集在一起，集群 2 病例也聚集在一起（图 2E）。

集群 1 和 2 与 RCC 的临床病理学特征（T 状态）相关

为了进一步了解聚类结果，对两个聚类中 634 名 RCC 患者的总生存期进行了 Kaplan-Meier 分析。结果表明，与集群1相比，集群2的预后更差，但差异不显着（P=0.084；图 3A）。此外，这些集群与 T 状态显着相关（图 3B）。总的来说，结果表明这些集群与 RCC 密切相关。

基于 m6A RNA 甲基化调节剂的预后风险模型

随后，评估了 m6A RNA 甲基化调节因子的表达水平与 RCC 患者预后之间的关联。根据 TCGA 数据库中调节因子的表达水平进行单变量 Cox 回归分析。结果表明，WTAP（风险比 [HR]，1.051；95% 置信区间 [CI]，1.021–1.082），HNRNPC（HR，1.016；95% CI，1.003–1.028），METTL3（HR，1.086；95% CI，1.017–1.161）、YTHDC1（HR，0.955；95% CI，0.90–0.98）和 METTL14（HR，0.730；95% CI，0.638–0.836）与总生存期显着相关（图 4A）。

此后，选择了TCGA数据单变量分析中P<0.001的两个基因（METTL14和WTAP），随后应用LASSO Cox回归算法。通过最低标准选择这两个基因作为风险特征。然后使用从 LASSO 算法获得的系数确定风险评分（图 4B和和 C)。C）。然后根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。

风险评分与 RCC 的临床病理学特征相关

为了进一步分析风险评分与 RCC 患者临床特征之间的关联，评估了高/低风险组与总生存期和各种临床病理学特征之间的关联。首先，结果表明，与低风险组相比，高风险组的总生存期更差（图 5A）。其次，确定了高/低风险组与临床病理特征之间的关联，包括 TNM 状态、分期和性别。表 2），并确定了高/低风险组与 M 状态、T 状态、阶段和性别之间的强关联（图 5C）。结果还表明，与低风险组相比，WTAP 下调，而 METTL14 在高风险组中上调。

ROC 曲线分析用于进一步验证风险签名的预测性能。ROC 曲线下面积为 0.701 (图 5B)，这表明该模型具有较高的预测性能。

基因表达综合 (GEO) 数据集中的验证

GSE29609 GEO 数据集（涉及 39名RCC 患者）用于进一步验证 RCC 患者风险特征的预后价值。根据中位风险评分，将 39 名患者分为高危组和低危组。结果表明，高危组患者的预后明显低于低危组患者（P<0.05；图 6）。结果与TCGA结果一致，表明风险模型准确有效。

Cox 回归分析表明风险特征是一个独立的预后指标

单变量 (图 7A) 和多变量 (图 7B) Cox 回归分析表明临床病理学特征（包括风险评分）与总生存期之间的关联。结果表明，年龄、分期和风险评分与 RCC 的总生存期显着相关。图 7A和和 B)。乙）。总的来说，这些结果表明，从风险特征中获得的风险评分可以作为 RCC 患者总体生存率的独立预后因素。

验证两种 m6A RNA 甲基化调节剂的 mRNA 和蛋白质表达水平

为了进一步验证我们的结果，来自人类蛋白质图谱 (HPA) 数据库的信息用于分析两种 m6A RNA 甲基化调节因子的蛋白质表达：METTL14 和 WTAP。METTL14 在 RCC 组织中的蛋白表达高于正常组织（图 8A），而WTAP在正常组织中的蛋白表达高于RCC组织（图 8B）。这些结果与 METTL14 和 WTAP 在 mRNA 水平的表达一致（图 8C和D);D); 我们的结果显示，与对照肾细胞系（293T）相比，RCC 细胞系（786-0 和 769-P）中的 METTL14 mRNA 显着降低，而 RCC 细胞系（786-0 和卡基-1)。这些结果表明 METTL14 和 WTAP 在 RCC 的 mRNA 和蛋白质水平上均表现出显着变化，表明它们在 RCC 中具有重要作用。

讨论

大多数 RCC 病例是透明细胞 RCC。3早期肾细胞癌患者无明显症状，部分患者在病理诊断时已发生转移。分子靶向治疗容易产生耐药性。RCC患者通常预后不良，5年生存率<40%。25基于干扰素和白细胞介素 2 的免疫疗法作为一线治疗，有 15% 的疗效。26 RCC 的发生和发展是一个复杂的过程，涉及许多因素，如吸烟、肥胖、遗传和细胞周期变化。27因此，RCC 背后的精确机制是复杂的。基于这些机制开发新的治疗策略至关重要。

RNA 的 m6A 修饰是指在甲基转移酶的催化下，腺嘌呤 (A) 的第 6 位氮原子发生甲基化。28每个 mRNA 有 3-5 个 m6A 甲基化位点，在转录后水平调节 RNA 稳定性、定位、运输、剪接和翻译。29越来越多的证据表明 m6A 修饰在急性髓性白血病 (AML)、肝细胞癌 (HCC)、乳腺癌和其他类型的癌症中的作用。在恶性肿瘤中，m6A修饰可以诱导致癌或抗癌作用。然而，关于 m6A 甲基化调节因子在 RCC 中的作用知之甚少。本研究中涉及 RCC 中 m6A RNA 甲基化调节因子的风险模型为进一步研究 RCC 提供了新的见解。

根据本研究中分析的 893 个 RCC 和 128 个正常组织，与正常对照组相比，RCC 患者中 13 个 m6A RNA 甲基化基因的表达发生了显着改变，这表明 m6A RNA 修饰可能在 RCC 中起作用。在13个监管机构中，FTO表达的变化最为显着。FTO 是非血红素 Fe (II) 和 α-酮戊二酸依赖性双加氧酶 ALKB 蛋白家族的成员。30最近的研究表明，FTO 表达可能与几种肿瘤有关，例如乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌和胃癌。31、32 Li 等人报道，FTO 通过降低 ASB2 和 RARA 靶基因中的 m6A 水平来影响白血病的发生和耐药性。33Zhou等证实宫颈鳞状细胞癌（CSCC）患者FTO表达明显升高，FTO和β-catenin表达在CSCC中具有预后价值。34上述这些研究调查了癌症发展过程中 FTO 诱导的 m6A 修饰的生物分子机制，但还需要进一步研究。

为了进一步研究 13 m6A 调节剂对 RCC 临床特征和预后的影响，从 TCGA 数据库下载临床数据进行分析。进行共识聚类以将 RCC 病例分为两个集群。结果表明，这些簇与 RCC 的临床病理学特征（T 状态）相关。结果还表明，m6A RNA 甲基化调节因子的表达在两个簇之间存在差异。因此，该分析表明 m6A RNA 甲基化调节因子与 RCC 密切相关。

通过进行单变量 Cox 回归分析，进一步研究了 m6A RNA 甲基化调节因子与 RCC 预后之间的关联。根据结果，选择 P<0.01 的两个 m6A RNA 甲基化调节因子（METTL14 和 WTAP）进行 LASSO Cox 回归分析以建立风险特征。此外，基于热图，与低风险组相比，高风险组的 METTL14 上调和 WTAP 下调。虽然 METTL14 和 WTAP 都是作家，但它们在肿瘤中的表达水平和作用并不相同。WTAP 在促进肿瘤发生和发展的 AML 中上调。相比之下，METTL14 在 HCC 中下调，具有抑制作用。35 , 36每个 m6A RNA 甲基化调节剂在不同肿瘤中的作用不同。例如，METTL3 在胶质母细胞瘤中下调并具有抑制作用，但在肺癌和 HCC 中上调。37-39 METTL14 和 WTAP 在 RCC 中的作用尚未完全了解，需要进一步研究。

我们的结果表明，高/低风险组（基于中位风险评分）与 RCC 预后显着相关。此外，风险特征的ROC曲线下面积为0.701，表明模型的预测性能良好。此外，高/低风险组与临床病理学特征相关（P<0.05；T 状态、M 状态、分期和性别）。最后，进行单变量和多变量 Cox 回归分析以评估风险评分（和其他临床病理学特征）与总生存期之间的关联。结果表明，风险特征可能作为 RCC 的独立预后因素。因此，WTAP 和 METTL14 可作为 RCC 的独立预后因素。

WTAP 是 m6A 甲基化修饰40中的必需蛋白，因为它协调 METTL3-METTL14 异二聚体定位并促进 m6A 甲基化。16这表明 WTAP 的致癌作用可能与 m6A 甲基转移酶复合物密切相关。此外，WTAP 与其他癌症的发展有关。发现 WTAP 表达在胰腺导管腺癌 (PDAC) 中显着增加，并且是 PDAC 中的独立预后因素。41 WTAP 可能通过调节 CDK2 mRNA 的稳定性影响 RCC 细胞增殖，从而导致癌症的发生和发展。41因此，WTAP 可作为 RCC 诊断和治疗的新靶点。

METTL14 是 m6A 甲基转移酶复合物的重要组成部分。15最近的研究报告了它在肿瘤恶性表型中的作用。一项研究表明，在 AML 细胞系中敲除 METTL14 可有效抑制增殖。42此外，METTL14 和 FTO 在 HCC 中下调，36这表明 m6A 修饰涉及复杂的反馈调节机制，涉及写入器和擦除器。迄今为止，很少有研究调查 METTL14 在 RCC 中的作用。该研究表明，与低风险组相比，METTL14 在高风险组中上调，这表明 METTL14 上调与 RCC 预后不良有关。

m6A 甲基化调节因子的具体调节及其潜在的生物学功能需要进一步研究，特别是关于本研究风险特征中包含的两个 m6A 基因（编码写入者）。