博奥时空组学又双叒发文丨单细胞与空间转录组珠联璧合构筑间质性膀胱炎的空间免疫图谱
2022年5月20日，四川大学华西医院泌尿科李虹、罗德毅教授团队在 Signal Transduction and Targeted Therapy （IF：18.19）杂志上发表了题名为“Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis”的研究论文。文中的单细胞转录组与 10x 空间转录组由博奥晶典提供技术服务。
该研究利用单细胞转录组、10x 空间组学和质谱流式（CyTOF）技术对间质性膀胱炎（IC）的免疫微环境进行深入研究，文章刻画了 IC 患者的膀胱免疫图谱，探索了免疫细胞的亚群特征、分布及相互作用关系。结果发现尿路上皮细胞在 IC 的病理生理机制和疾病进展中可能发挥着重要作用，并且尿路上皮细胞和成纤维细胞可能协调 IC 膀胱中免疫细胞的激活、归巢和相互作用，然而异常激活的免疫细胞和部分效应细胞的功能丧失导致膀胱免疫微环境失衡、膀胱功能障碍及解剖结构的破坏，致使患者出现下尿路症状及膀胱纤维化的转归。同时，文章发现了一些具有潜在诊断功能的尿液标志物，如 IgE 和 CCL5。本文为 IC 的基础研究和诊断治疗提供了丰富的科学线索和理论依据。
科学问题
间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）是目前妇科泌尿领域最为棘手的一种疾病，主要的临床表现为尿频和充溢性膀胱剧烈疼痛。临床常用的治疗方案在长期的随访中效果均不佳，约 10% 的患者最终会因为无法忍受该疾病带来的痛苦和精神压力，选择膀胱全切。该疾病的存在已有超过 100 年历史，但至今病因不明，近年来免疫学说在 IC 的发病机制中备受关注，但免疫在 IC 发生发展过程中扮演着什么样的角色以及具体在 IC 进程的哪个阶段发挥效应作用并不清楚。
目前对于 IC 免疫微环境的研究主要通过病理切片染色、流式细胞学以及 Bulk RNA 测序等技术对膀胱组织、血液、和尿液进行初步分析，它们在多大程度上能反映 IC 炎症情况、细胞亚群、分布和状态尚不清楚。
技术路线
主要研究结果
1、IC 膀胱免疫图谱
从 IC 患者和对照者膀胱中捕获 135091 个CD45+ 免疫细胞，数据质控后保留 92029 个高质量免疫细胞进行后续分析。通过经典 marker genes 鉴定分群并构建 IC 免疫图谱。图谱中共有 22 种免疫细胞类型，其中发现的 pDC、USMB、TBC、效应记忆 T 细胞等细胞类型进一步完善了 IC 膀胱免疫亚群的丰富度（图1 a-h）。
2、CD8+ T 细胞功能障碍和 B 细胞的异常活化
T 细胞的再聚类共鉴定出 9 个 T 细胞亚群（图2 a-b）。细胞比例分析可见 IC 膀胱中 Tregs 细胞的增加以及 Th17 细胞的减少（图2 c）。与对照组相比，IC 中 Tregs 的差异基因主要富集在 mRNA 分解代谢、病毒受体和局灶黏附过程（图2 d）。而 Th17 细胞的差异基因主要富集于经典炎症信号通路（图2 e）。重要的是，IC 组 CD8+ T 细胞可见耗竭基因高表达，表明其效性功能受损，病原体清除能力降低（图2 f、g）。
B 细胞再聚类鉴定出 6 个亚群（图2 h-i），IC 膀胱中活化 B 细胞 Act B 和非转换记忆 B 细胞 USMB 显著增加，转换记忆 B 细胞 SMB 和过渡 B 细胞 TBC 显著减少。IC 组中活化 B 细胞占 46.32%，B 细胞异常活化提示 IC 膀胱中存在较强的体液免疫反应。随后的尿液抗体检测发现 IC 患者尿液中 IgE 明显升高，提示 IgE 可作为 IC 潜在的快速诊断标记物（图2 l）。
3、髓系细胞的亚群分析
髓系细胞再聚类发现 6 种细胞类型（图3 a）。IC 组中主要的细胞类型为中性粒细胞（51.20%），与对照相比，其差异基因显著富集于抗原提呈和类风湿关节炎通路相关（图3 b-c）。有趣的是临床中常用于鉴别 IC 的肥大细胞其数量并不多，组间也无统计学差异（图3 b）。
拟时序分析描绘了从 CD14+ 巨噬细胞到 M2 样巨噬细胞的分化轨迹（图3 d、e），在分化过程中，促炎基因在 CD14+ 巨噬细胞中上调，随着病程进展逐渐下调。同时，吞噬基因和调控受体在 M2 样巨噬细胞中逐渐上调（图3 f）。与对照相比，CD14+ 巨噬细胞的功能与促炎有关（图3 g）。而 M2 样巨噬细胞则主要通过 MHCII 类分子调节免疫（图3 h），其差异基因主要富集于自身免疫性疾病（图3 i）。两种巨噬细胞的功能变化与 IC 从炎症到纤维化的转归相关。随后的免疫荧光验证了两种巨噬细胞的存在（图3 j）。
4、CyTOF 验证免疫细胞亚群
前三部分文章通过 scRNA-seq 构建了 IC 膀胱免疫图谱。随后通过 CyTOF 对上述结果进行蛋白水平的验证，结果表明 IC 膀胱中的主要细胞类型及比例变化均与 scRNA-seq 结果保持一致，进一步验证了 IC 膀胱的免疫细胞图谱（图4）。
5、IC 膀胱中的免疫互作网络
研究者对图谱中的免疫细胞进行受配体分析并通过细胞间的相互作用构建了 IC 组的免疫激活网络（图5 a-b），结果发现上皮细胞和成纤维细胞可能协调免疫细胞在 IC 患者膀胱中的转移、归巢和激活，造成强烈的炎症反应（图5 c-d）。通过 ELISA 证实了新发现的趋化因子 CCL5 在 IC 患者尿液中的高表达（图5 e)，表明 CCL5 可能是一个潜在的尿液生物标志物。
IC 膀胱中 Tregs 表达的 IL-10 和 IL-35 的显著减少（图5 f），而同时发现 TGF-β 信号通路的上调（图5 g），表明 IC 膀胱中 Tregs 的功能障碍，炎症平衡能力受损。Tregs 功能障碍与 CD8+ T 细胞耗竭可能是 IC 炎症持续的原因，最终导致 IC 膀胱解剖结构破坏及纤维化转归。
此外， IC 患者尿路上皮细胞和成纤维细胞差异基因富集于病毒感染相关功能（图5 h-i）。上皮细胞转录因子也与病毒感染相关（图5 j-k）。数量变化较大的细胞群，其差异基因也均与病毒感染相关。随后，研究者收集了 IC 患者尿液进行病毒检测，结果在 IC 尿液中检测到人类多瘤病毒-2（阳性率为95%，19/20），而对照中未发现（图5 l）。这一发现将为 IC 的病因学和病理生理机制提供新的线索和理论依据。
6、ST 和 scRNA-seq 的 MIA 分析揭示 IC 与对照膀胱中免疫细胞的差异分布
取 IC 和对照膀胱进行空间转录组学，并进行聚类分析和分群鉴定（图6 a-d，h-j）。通过 marker genes 可辨认膀胱解剖结构。基因表征发现纤维化相关基因在 IC 组的不同细胞类型中高表达，而对照组则低表达，再次提示患者膀胱可能存在严重纤维化（图6 e、k）。
随后使用多模态交叉分析（MIA）联合单细胞数据和空间数据，发现 IC膀胱中免疫亚群几乎都富集于尿路上皮区域或成纤维细胞附近（图6 f），但只有部分免疫细胞亚群在对照组膀胱的尿路上皮和平滑肌细胞周围被发现（图6 l）。结果再次证实了尿路上皮细胞和成纤维细胞在 IC 发病中的重要作用。
总结
该研究利用单细胞 scRNA-seq、10x 空间转录组学和质谱流式（CyTOF）技术对 IC 膀胱免疫亚群和免疫微环境进行研究。文章构建了 IC 女性膀胱的空间免疫图谱，确定了免疫细胞的亚群特征，并探索了它们之间的相互作用关系。结果发现尿路上皮细胞在 IC 的发生和进展中可能发挥重要作用，尿路上皮细胞和成纤维细胞可能协调免疫细胞在 IC 患者膀胱中的归巢、迁移和激活，而异常激活免疫细胞引发膀胱功能障碍，导致膀胱结构破坏，造成膀胱的严重纤维化。此外，文章发现了一些具有潜在诊断功能的尿液标志物，同时发现患者尿液中 2 型多瘤病毒的存在，本文为研究 IC 的病理生理学研究奠定了基础。
参考文献：
Peng L, Jin X, Li BY, Zeng X, Liao BH, Jin T, Chen JW, Gao XS, Wang W, He Q, Chen G, Gong LN, Shen H, Wang KJ, Li H, Luo DY. Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis. Signal Transduct Target Ther. 2022 May 20;7(1):161. doi: 10.1038/s41392-022-00962-8.
