华山参滴丸抑制气道平滑肌收缩的抗哮喘机制研究
来源 TMR Publishing Group作者 Traditional Medicine Research 编辑部

哮喘是一种慢性炎症,导致气道阻塞和气道平滑肌(ASM)对直接或间接刺激产生高反应性,导致支气管收缩。气道平滑肌细胞是调节气道阻力和高反应性的主要细胞,是哮喘和疾病加重的显著特征。除了过敏性哮喘产生的炎症反应会调节ASM的收缩性外,药用植物对气管平滑肌的松弛作用还有多种调节机制,如钾通道开放、钙通道阻断、ß2-肾上腺素能受体刺激、一氧化氮(NO)产生、环氧合酶(COX)途径和磷酸二酯酶(PDE)活性等。
华山参(HSS)最早记载于《本草纲目增编》,已广泛用于哮喘的治疗。HSS滴丸充分利用其消炎、祛痰、止咳作用,由华山参为原料,由黄芪提取物组成。HSS滴丸是中国药典(批准号:Z10900001)正式上市的专利药物。HSS滴丸含有11种生物碱,如阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱。据报道,山莨菪碱可减少嗜酸性气道炎症和气道高反应性。
然而,HSS滴丸的抗哮喘机制研究较少。与此同时,目前尚不清楚是哪种化合物有抗哮喘的作用。本研究旨在探讨口服HSS滴丸后大鼠血浆中的主要成分,并探讨其治疗的可能机制。然后,通过离体气管模型研究了HSS滴丸的抗哮喘机制。
研究方法
本文采用高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法(HPLC-QTOF-MS)鉴定了口服HSS后大鼠血浆中的成分。利用卵清蛋白(OVA)致敏的过敏性哮喘模型,探究HSS抗过敏性哮喘的可能机制。此外,利用Wistar大鼠的离体气管探究HSS对ASM松弛的影响。
研究结果
大鼠血浆中HSS吸收情况的鉴定
采用HPLC-QTOF/MS法分析大鼠血浆中的成分。在含有HSS的血浆中,可明显检测到阿托品、 山莨菪碱和东莨菪碱作为毒蕈碱拮抗剂(图2)。根据之前报告中HSS的成分分析,通过将其保留时间和质谱与标准品的特性进行比较,确定了D-山莨菪碱、L-山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品(表1)。D-山莨菪碱在m/z306.1697处产生了一个前驱体离子[M+H]+。L-山莨菪碱的特征离子与D-山莨菪碱相同,而不同的保留时间值是其差异的一个指标。东莨菪碱在m/z304.1537处产生了一个前体离子[M+H]+。在m/z156.1014[m+H]+处的片段离子是由亲本离子中丢失一个中性片段(C9H8o2)产生的。阿托品在m/z290.1749处产生了一个前体离子[M+H]+。在m/z124.1119[m+H]+处的片段离子是由母离子失去莨菪酸(C9H10O3)而产生的。结果表明,山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品是HSS的活性成分。

HSS减轻了过敏性哮喘的气道炎症反应观察小鼠的行为(图2A1-4和B1-3)所示,与对照组小鼠相比,OVA诱导小鼠的平均速度、线性和活动显著降低。然而,与模型组相比,HSS组和地塞米松(DM)组小鼠活动、线性和平均速度显著增加。为观察HSS是否能抑制过敏性哮喘的炎症反应,我们观察了肺组织。与对照组相比,模型组肺组织中存在炎症细胞浸润、气管收缩、气道上皮增生、基底膜增厚(图2C1和C2)。与模型小鼠相比,HSS组和DM组的肺组织学变化明显受到抑制(图2C2-4)。与对照组相比,模型小鼠BALF中IgE、IL-4、IL-5、ET-1和蛋白水平大幅增加,而BALF中的INF-γ水平下降(图2D1-D6)。HSS组和DM组与模型小鼠相比,显著降低了BALF中IgE、IL-4、IL-5和ET-1的含量,并提高了INF-γ水平。
HSS抑制了Ach诱导的ASM的收缩采用气管环法测量HSS的剂量效应,进一步评价气管平滑肌的舒张程度。结果显示,Ach收缩的气管环具有显著的浓度依赖性松弛效应(图3A和B)。为评估HSS放松气管活动的因素,分别检测对照组和模型组中的普萘洛尔、茶碱、消炎痛和L-NAME。普萘洛尔,茶碱,消炎痛和L-NAME均无显著差异,表明HSS的气管松弛作用不受β-肾上腺素能受体、PDE、COX和NOS的影响(图3C-F)。

HSS影响钾通道,钙的流入和释放采用Ca2+激活的通道抑制剂TEA,KV通道抑制剂4-AP和KATP通道抑制剂格列本脲作为不同药物作用的K+通道阻滞剂,评价HSS对气管平滑肌的弛缓作用。如图4A-D所示,TEA对HSS诱导的反应有影响(38.56±4.33%,p<0.001)。然而,4-AP和格列本脲对HSS诱导的反应没有影响。结果表明,HSS影响了KCa通道放松ASM。为了确定HSS的支气管扩张是否由Ca2+内流介导,我们观察了HSS对氯化钙曲线的影响。结果发现,HSS使氯化钙最大收缩值降低36.98±14.96%。硝苯地平预处理也将最大收缩量降低至44.90±3.40%(图4E)。上述两次收缩均低于对照组,说明HSS抑制采用Ca2+流入从而松弛ASM。HSS预处理15min使Ach诱导的收缩显著降低至76.63±7.12(图4F),高于对照组。这表明HSS抑制了Ca2+的释放从而松弛了ASM。

钾通道抑制剂、钙的流入和释放对阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱诱导弛缓的影响随后,测定血浆中的生物碱(包括阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱),以确保K通道中哮喘的活性成分和钙的内流或释放。结果显示,TEA对山莨菪碱和东莨菪碱诱导的反应有影响,但对阿托品的诱导没有影响(图5A-C)。此外,阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱均影响钙的流入和释放(图5D-E)。
结论本研究采用HPLC-QTOF-MS方法对大鼠血浆中D-山莨菪碱、L-山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品进行分离鉴定。通过哮喘动物模型和离体气管实验,发现HSS抑制炎症介质的释放,调节的平衡Th1/Th2减少气道炎症,和放松气管平滑肌通过控制KCa通道,Ca2+流入和释放减少气道高反应性。阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱可能是HSS的活性成分。因此,本研究有助于了解HSS治疗哮喘的作用机制,为今后的研究奠定基础。
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引用格式
Liu Y, Cui NN, Liu XS, et al. Anti-asthmatic mechanism of the Huashanshen dripping pill via suppressing contraction of the airway smooth muscle. Tradit Med Res. 2022;7(3):20. doi:10.53388/TMR20211124252
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