去泛素酶USP1的抑制使KPNA2不稳定并抑制乳腺癌转移

写在前面

        今天推荐的是由上海交通大学医学院及上海肿瘤研究所等团队在2018年12月7日发表于Oncogene（IF：7.744）的一篇文章，通讯作者是Yongzhong Liu教授，研究表明抑制去泛素酶USP1使KPNA2不稳定并抑制乳腺癌转移。

研究背景

        乳腺癌是全世界女性最常见的癌症，发生转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，而新兴证据表明，复杂的转移过程与蛋白质修饰的失调有关。泛素化是一种可逆的翻译后修饰，可以调节蛋白质的稳定性、活性和定位。去泛素酶（DUBs）负责从底物蛋白上去除泛素链或泛素分子以控制修饰。DUBs功能异常引起的泛素化不受抑制与包括癌症在内的各种疾病的发生和发展有因果关系，乳腺癌转移便与这种异常的泛素化调控有关。由于DUBs在乳腺癌发病机制中的重要作用，基于其临床潜力，有必要对DUBs的药理靶向性进行更多的研究。

摘要部分

        泛素特异性肽酶1（USP1）属于DUBs的USP家族，与其他USP蛋白类似，USP1含有高度保守的Cys和His结构域，其中Cys90位点对于DUB的活性至关重要。目前，人们关于USP1在乳腺癌的发展和转移扩散中的作用还知之甚少。本研究证明了去泛素酶USP1的过度激活有助于乳腺癌的转移。原发性乳腺癌标本中USP1表达上调与乳腺癌患者转移性进展和不良预后相关。研究表明，USP1可增强乳腺癌细胞中多个促转移基因的表达，同时促进细胞在体外的迁移和侵袭以及乳腺癌细胞的肺转移。 
        另外，作者还确定了KPNA2为具有促进乳腺癌细胞转移能力的USP1的去泛素化底物。更重要的是，特定的抑制剂Pimozide或ML323对USP1功能的药理学干预可显著抑制小鼠乳腺癌的转移，这提示了使用USP1抑制剂治疗乳腺癌患者的基本原理。因此，作者的研究揭示了USP1可作为治疗乳腺癌的新靶点，并提供证据表明使用抑制剂干扰USP1可能是抑制乳腺癌转移的潜在方式。

研究内容

1.促进乳腺癌细胞转移的去泛素酶USP1的鉴定

        为了鉴定调控乳腺癌细胞转移的去泛素化酶（DUBs），作者最初利用transwell迁移测定法筛选出了一组DUBs，它们在乳腺癌组织中表达水平相对较高。作者用针对每种DUBs的三种非重叠siRNA混合物转染了细胞，结果显示USP1的沉默显著降低了MCF7细胞的迁移能力。进一步的实验表明USP1的下调可显著抑制细胞的迁移和侵袭能力，但对细胞增殖无明显影响。与这些结果一致，过表达UPS1可极大增强细胞的迁移和侵袭能力。     
        接下来，作者探究了USP1在人乳腺癌细胞中的促转移活性在高转移性小鼠4T1细胞中是否保守。结果显示，USP1缺失也可显著抑制4T1细胞的迁移和侵袭，而USP1过表达产生了相反的作用。为进一步证实USP1在乳腺癌中的功能，作者探究了USP1是否促进乳腺癌的体内转移。结果表明，携带USP1缺失的4T1细胞的小鼠肺部表面转移性结节比对照组小鼠少，而USP1的过表达显著加重了小鼠肺组织中4T1细胞的转移损伤。有趣的是，USP1的过度表达或缺失并没有明显改变原发性4T1肿瘤的生长。

研究结论：USP1是一种在乳腺癌细胞中具有促转移活性的去泛素酶，但不影响细胞增殖。

2.USP1表达与人类乳腺癌的不良预后相关       

        为进一步探讨USP1表达与人类乳腺癌的临床相关性，作者首先通过免疫组化染色分析比较了两组人类乳腺癌组织微阵列（TMA）中USP1的蛋白水平。作者发现，与非肿瘤组织相比，USP1在肿瘤组织中的表达上调，而且与原发性肿瘤细胞相比，在淋巴结转移灶内的癌细胞中甚至存在更高水平的USP1。通过分析公开数据集中患者样本的USP1水平，作者发现USP1的高表达与远处无转移的生存率降低相关。     
        接下来，作者使用数据集进行了基因集富集分析（GSEA），结果显示高表达USP1的患者脑复发和肺转移中表达上调的基因均显示富集，这表明与低表达USP1的患者相比，高水平USP1个体的肿瘤组织更倾向于发生远处转移。作者使用公共数据库调查了不同癌症阶段之间USP1的表达模式，观察到在较高阶段中的USP1表达升高。GSEA分析表明，已知III级癌中上调的基因在高水平USP1的患者中显著富集。因此，USP1水平高的患者富集了与乳腺癌不良预后相关的基因标签。

 研究结论：USP1促进人类乳腺癌的转移且与不良预后相关，高表达的USP1个体更容易出现预后不良。

3.USP1促进人乳腺癌中促转移分子的表达

        接下来，作者通过RNA测序检查了转录组数据，发现与对照组细胞相比，在用两个独立的USP1 siRNA转染的细胞中，一系列转录产物的表达同时发生了变化。对表达谱的分析表明，沉默USP1所影响的过程包括粘着斑粘附、癌症中的蛋白聚糖、ECM-受体相互作用和TGF-β信号传导。独创性途径分析（IPA）显示了与乳腺癌细胞运动和迁移相关的基因的USP1依赖性富集。值得注意的是，许多与乳腺癌转移相关的基因，例如S100A4，TIMP1，TIMP2，COL6A2，PGF，FYN，ITGA5，ITGA6，LOXL2，CLDN4和SPARC，都因USP1缺失而呈现转录水平的下调。作者用定量实时PCR（qRT-PCR）进一步验证了几种差异基因的表达。       
        为了进一步确定由USP1缺失引起的转录本差异表达模式是否相应地存在于临床乳腺癌中，作者根据USP1水平将乳腺癌样本分为两组，从而分析了人类乳腺癌转录组数据集GSE15852。结果表明，参与粘着斑通路和乳腺癌细胞运动的几种基因的表达都与USP1转录本水平呈正相关。

研究结论：USP1可促进乳腺癌中促转移基因的表达。

4.USP1通过去泛素化作用与KPNA2相互作用并使其稳定

        为了进一步阐明USP1在乳腺癌中促转移的分子机制，作者通过亲和纯化和质谱对USP1的相互作用组（所有与其相互作用的分子）进行了分析。质谱分析表明，已报道参与癌症转移的核蛋白KPNA2是与USP1相互作用的蛋白之一。体外的免疫共沉淀实验结果也显示USP1和KPNA2之间有相互作用。作者又通过在MCF7和MDA-MB-231细胞中使用抗USP1或抗KPNA2抗体进行co-IP检测，进一步证实了USP1和KPNA2的内源性相互作用，另外发现了过表达USP1和KPNA2的共定位主要在MCF7的细胞核中。     
        接下来，作者直接评估了USP1是否可以调节乳腺癌细胞中KPNA2的表达。结果显示，乳腺癌细胞中USP1缺失显著抑制了KPNA2的表达，而过表达USP1则显著增加了KPNA2的表达水平。各类实验结果表明，USP1与KPNA2相互作用并促进其在乳腺癌细胞中的表达。

        由于USP1的缺失并未显著改变乳腺癌细胞中KPNA2的mRNA水平，因此作者进一步探讨了KPNA2上调是否在功能上需要USP1和KPNA2的相互作用。实际上，USP1的过表达显著提高了用环己酰亚胺（CHX）处理的细胞中KPNA2蛋白的稳定性，而敲低USP1则加速了KPNA2的降解。重要的是，蛋白酶体抑制剂MG132大大抑制了USP1缺失引起的KPNA2的下调。这些结果表明，USP1参与了乳腺癌细胞中KPNA2的翻译后调控。为了进一步证实这些发现，作者探究了USP1是否调节KPNA2的泛素化。结果显示，过表达USP1的细胞中KPNA2蛋白的泛素化程度大大降低。相反，敲低USP1的细胞中KPNA2泛素化水平显著提高。接下来，作者通过将泛素化的KPNA2与纯化的野生型USP1或不具酶活性的突变体C90S蛋白进行共同孵育来进行体外去泛素化检测。结果显示，WT-USP1有效地从KPNA2蛋白中去除了泛素链，但C90S突变体并未产生明显的调节作用。

5.USP1通过调控KPNA2促进乳腺癌的转移

        已知KPNA2可以促进乳腺癌的转移，并与各种类型癌症患者的预后不良有关。为了评估USP1是否通过调控KPNA2来促进乳腺癌的转移进程，作者将靶向KPNA2的siRNA转染到强制表达USP1的MCF7细胞中。结果发现，KPNA2的沉默可以彻底抵消USP1介导的肿瘤迁移和入侵增强的效果。此外，KPNA2的过表达显著增强了对照细胞的迁移和侵袭，也可以使敲低USP1的MCF7的细胞迁移能力恢复。     
        接下来，作者进一步探究了KPNA2是否参与了USP1介导的基因表达调控，并发现在缺失KPNA2的细胞中，USP1调控的基因（例如PGF，ITGA6，SPARC，COL6A2，CAPN2，BMP6和LOXL2）的mRNA水平也被下调，而KPNA2的过表达有效地恢复了这些基因的表达。Snail是一种在癌症转移中具有重要作用的蛋白质，它在USP1或KPNA2基因被敲低的MCF7细胞中的表达水平被相应地下调。这些结果进一步将KPNA2定位为USP1在调节乳腺癌转移中的下游效应蛋白。     
        为了探究USP1是否在体内通过KPNA2的调控促进乳腺癌转移，作者在USP1过表达的4T1细胞中稳定敲低KPNA2，并将它们和对照细胞注射入雌性BALB / c小鼠的乳腺脂肪垫中。结果显示，USP1的转移活性至少部分是通过稳定KPNA2来介导的，因为相对于对照组，过表达USP1的4T1细胞中KPNA2的缺失显著削弱了肺结节转移结节的形成。更重要的是，USP1介导的KPNA2表达调控可以转化为临床应用。乳腺癌组织芯片免疫组化染色显示USP1和KPNA2的表达呈正相关。总之，这些结果强调了KPNA2在USP1介导的促进乳腺癌转移中的重要作用。

 研究结论：KPNA2是USP1在调节乳腺癌转移中的下游效应蛋白，USP1通过调节KPNA2促进乳腺癌的转移。

6.用Pimozide或ML323对USP1进行药物干预可抑制小鼠乳腺癌转移     
        接下来，作者探究了USP1的药理抑制作用是否可以对小鼠的乳腺癌转移产生抑制作用。为此，作者首先使用了USP1抑制剂pimozide，该药物已在临床上用于患有抽动秽语综合征、精神分裂症和慢性精神病的患者，其最近被证明可抑制USP1的表达和酶促USP1 / UAF1复合物的活性。结果显示，pimozide处理会导致乳腺癌细胞（MCF7，MDA-MB-231和4T1）中KPNA2和USP1的表达呈剂量依赖性降低。     
         为了探究pimozide是否会影响乳腺癌细胞的转移能力，作者用pimozide处理了这些细胞，并观察到pimozide显著抑制了肿瘤的迁移和侵袭能力，并抑制了几种促转移基因的表达。为了进一步研究pimozide对体内乳腺癌转移进程的影响，作者在雌性小鼠的乳腺脂肪垫中注射了4T1细胞，并在注射肿瘤细胞后第9天开始用pimozide对这些小鼠进行治疗。正如预期的那样，使用pimozide治疗可显著降低4T1原发性肿瘤中USP1蛋白的水平。在小鼠中，USP1靶标的大多数促转移基因在pimozide特治疗后在肿瘤中的转录水平降低。同时，作者发现全身使用pimozide可显著减少肺部表面转移性结节的数量，但并未影响肿瘤的生长。     
        另外，作者还发现了ML323作为一种高效能的USP1-UAF1的抑制剂，具有显著抑制乳腺癌细胞的迁移与侵袭的能力。体内实验数据进一步表明，ML323治疗也可抑制携带4T1肿瘤的小鼠的肺转移。

 研究结论：USP1抑制剂pimozide和ML323均可降低乳腺癌的转移能力，且没有明显的细胞毒性。

结论与讨论

        作者研究表明，USP1在体外和体内的乳腺癌转移中均起促进作用，还进一步揭示了USP1是通过介导KPNA2的去泛素化来促进癌细胞转移，值得注意的是，在临床乳腺癌样本中USP1和KPNA2的表达协同上调，进一步暗示了USP1调控KPNA2在乳腺癌转移中的病理意义。另外本研究还证实了USP1抑制剂Pimozide或ML323能有效抑制小鼠乳腺癌的转移。因此，未来需要进一步探讨靶向USP1在乳腺癌中的治疗意义。

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        原文链接：https://www.nature.com/articles/s41388-018-0590-8