欢迎光临散文网 会员登陆 & 注册

SUMO标签在蛋白表达中的应用

2023-11-29 13:27 作者:南京德泰生物  | 我要投稿

SUMO作为融合标签越来越多地用于表达系统中。融合标签不仅具有促进目的蛋白表达特性,而且还能防止目的蛋白降解,屏蔽某些毒性蛋白对宿主菌毒性,同时具有分子伴侣功能,能促进目的蛋白的正确折叠等特点。SUMO融合标签的更大的优势在于其具有与其配套的SUMO蛋白酶1。SUMO蛋白酶1具有较强的专一性,它所识别的区域并非氨基酸序列,而是蛋白质的三维结构,因此导致其切割效率高而且具有特异性。SUMO蛋白酶1识别SUMO三级结构后,能从SUMO末端的双甘氨酸处将目的蛋白从融合蛋白上切割下来,不存在任何氨基酸残留,适用于表达天然序列的重组蛋白。SUMO蛋白酶1可在较广pH范围(5.5-10.5)及温度(4-37℃)范围内将SUMO标签从融合蛋白上切割下来,且SUMO蛋白酶1对蛋白质纯化过程中用到的试剂,如咪唑、Triten、脲、盐酸胍等不敏感,甚至在2mol/L 脲的溶液中能成功切割,简化了蛋白质纯化过程。这相比于其他蛋白酶具有显著优势。SUMO融合技术已成为目前大肠杆菌重组蛋白表达和纯化的重要手段。

为了方便融合蛋白切割后利用亲和层析去除蛋白酶,重组SUMO蛋白酶多带有多聚His标签。使用SUMO标签进行蛋白表达流程包括以下几个步骤:构建带有His-SUMO标签的表达质粒、诱导表达带有His-SUMO标签的融合蛋白、使用Ni亲和纯化柱纯化融合蛋白、使用SUMO蛋白酶将融合蛋白酶切为His-SUMO融合标签和目的蛋白、使用Ni亲和纯化柱纯化,目的蛋白流出,SUMO蛋白酶和融合标签挂柱。

德泰生物SUMO蛋白酶为使用

E.coli

表达经亲和纯化的重组蛋白酶,带有多聚His标签,精准切割SUMO标签,特异性好,酶切效率高,可用于无标签蛋白的制备。 使用说明

1.酶切条件 推荐4℃酶切过夜,使用者可以根据自己研究的目的蛋白进行摸索。 2.酶切条件的优化 由于不同目的蛋白具有不同的特性,所以在实际使用时,建议对酶和待酶切的目的蛋白的比例进行适当优化。以下是一个简单的估计酶用量的实验方案。 a. 将反应混合物放置于30ºC反应1 h。如果目的蛋白在30ºC不稳定,可以考虑4ºC反应过夜(16 h左右)。 b. 带有SUMO标签的目的蛋白酶切反应的温度与时间,可以视情况进行适当调整,具体参考如下表格。 反应温度反应时间4ºC16 h16℃4 h25℃1.5 h30℃1 h c. 取20 µL样品进行SDS-PAGE电泳分析,确定反应所需的合适酶量。在实际操作过程中,如果有必要,还可以在上述反应的不同时间点取少量样品,后续通过电泳分析来确定优化的反应时间。

Lane1:纯化的SUMO融合蛋白X 2µg Lane2:纯化的SUMO蛋白酶 2µg Lane3-6:SUMO蛋白酶的用量从左至右依次为0.25U、0.5U、1U、2U,30ºC酶切反应1 h,取样进行SDS-PAGE电泳 Lane7:Lane6酶切条件放大,酶切后样品与Ni-NTA Resin结合后的流穿 SUMO酶切及镍柱回收参考图 3.酶切与纯化 后续可以按照上述优化的反应条件,放大反应体系进行目的蛋白SUMO标签的切除反应。反应结束后,可以通过镍柱结合去除切除下来的带有His标签的SUMO标签,以及带有His标签的本品,从而获得高纯度的无标签目的蛋白。

SUMO标签在蛋白表达中的应用的评论 (共 条)

分享到微博请遵守国家法律