01 背景介绍

药物中元素杂质一直是药物质量控制和保证(QC /QA)的重要组成部分，某些元素杂质（尤其是重金属元素）不仅会对药物的稳定性、保质期产生不利影响，更具有潜在的毒性，易引发人体疾病[1-3]。因此国际上近年来对药物中元素杂质的控制越来越严格，欧美早已在药典和指南中对元素杂质提出明确要求，如 EP 2.4.20.、USP <232>、USP ＜233＞，而ICH Q3D也对元素杂质的分类和控制提出了新的要求。我国于2017年6月加入ICH后对元素杂质的控制也逐渐接轨国际。因元素杂质的潜在来源有多处，如何将每种元素杂质控制在限度以下，确定元素种类和限度是前提，建立有效的分析方法是关键。本文笔者将重点介绍药物中元素杂质分析方法开发与验证要点，以供广大研究者参考。

02法规指南

2.1 法规要求

CDE：《化学仿制原料药CTD格式申报资料撰写要求（[2015]737号）》附件2中3.2.S.3.2 杂质；CDE：《已上市化学药品生产工艺变更研究技术指导原则（2017-08-21）》第三章 变更原料药生产工艺；CDE：《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求（2020-5-14）》第四章 原辅包质量控制技术要求和第五章 质量研究与控制技术要求。2.2 参考指南

EMA：《Guideline on the Specification Limits for Residues of Metal Catalysts or Metal Reagents》；ICH Q3D：Guideline for Elemental Impurities；USP <232> Elements and Limits；USP <233> Elemental Impurities—Procedures；EP 2.4.20. Determination of Elemental Impurities。

03 分析方法开发流程

元素杂质的分析方法开发主要按下图中的流程进行：

3.1 确定待测元素种类和限度

3.1.1 确定待测元素种类

确定待测元素种类主要依据ICH Q3D中的要求，全面评估元素杂质的潜在来源并识别已知和潜在的元素，元素杂质的来源主要包括：在原料药、辅料或其他药品组分生产中有意添加元素（如催化剂）的残留；非有意添加但在药品生产所用原料药、水或辅料中可能存在的元素杂质；生产设备可能引入到原料药和/或制剂中的元素杂质；包装系统可能浸出至原料药和制剂中的元素杂质；原料药、辅料和制剂的生产环境中可能存在的元素杂质……图1可帮助研究者全面、清晰地分析元素杂质的潜在来源。

▲ 图1-元素杂质的潜在来源概览
ICH Q3D中列举了24种元素并根据风险等级进行分类，还根据给药途径和是否有意添加确定是否需要对该元素进行控制，如表1所示。▲ 表1-风险评估需控制的元素杂质

以上元素的分类注释：1类 ：砷、镉、汞和铅，毒性明显，药品生产中不得使用或限制使用，所有给药途径必须对该 4 种元素评估；
2A类：钴、镍、钒，这些元素在制剂及设备中出现的可能性较高，需对所有潜在来源和给药途径进行风险评估；2B类：元素在药品中出现的可能性较低，除非在生产中有意添加，否则可不评估；
3类 ：口服毒性低，对注射和吸入给药药品，若给药途径的 PDE（permitted daily exposure，允许日暴露）值不超过 500 μg/d，则需评估 ；若该类元素在生产中被有意加入均需评估；
其他：铝、硼、钙、铁、钾、镁、锰、钠、钨、锌等元素，毒性低，未建立 PDE，是否进行风险评估需遵从特定元素的其他指导原则和/或地方法规和规范或药品的质量标准；如笔者曾做过亚甲蓝原料药中元素杂质的研究，其中的铝、镁、铁、锰、锌五种元素均是参考USP[4]和EP[5]中亚甲蓝的质量标准进行分析研究。

3.1.2 确定各元素的限度

各元素的限度确定首先参考ICH Q3D中的计算方法，如公式（1）。该指南中也列出了不同给药途径下1、2、3类元素的PDE值，如表2，可直接运用。而其他元素的PDE值并未列出，可通过动物毒理学实验后再根据公式（2）计算，或参考其他指南和药品已有的质量标准确定限度，如EMEA：《Guideline on the Specification Limits for Residues of Metal Catalysts or Metal Reagents》中列出了铁、锰、锌的PDE值（见表3）；又如笔者在做亚甲蓝原料药中元素杂质的研究时，参考的EP亚甲蓝质量标准中直接列出了12种元素的限度值（见表4）。

(1)

(2)

式中：NO[A]EL为未见反应剂量/未见不良反应剂量；若没有此数据也可使用最低可见反应剂量/最低可见不良反应剂量（LO[A]EL）；F1到F5为调整因子，在ICH Q3D附录1中均有详细描述

▲ 表2-各元素PDE值

▲ 表3-几种金属催化剂或金属试剂元素的PDE值和限度值

▲ 表4-EP中亚甲蓝质量标准确立的12种元素的限度值

3.2 前处理方法选择

样品前处理是元素杂质分析之前的关键步骤。通常情况下，元素杂质在复杂的基质中以低浓度存在，因此在样品前处理中应防止元素杂质的损失及二次污染。USP ＜ 233 ＞ 规定了4 种优选的前处理方法(图 2)，其中直接水溶液和间接溶液被采纳最为广泛。

▲ 图2-USP ＜233＞ 规定的4种优选的前处理方法

3.2.1 直接溶解法

对于微量和痕量元素杂质分析而言，优先选用无机酸或者水简单溶解以制备样品。根据 USP ＜233＞，可溶性固体和液体样品可用稀硝酸(HNO3 )溶解，或用浓硝酸溶解后加水稀释以降低酸的浓度，硝酸浓度通常在1%～10%，过高的硝酸浓度易造成分析时背景值偏高从而降低仪器分析灵敏度。对于Hg、Pd、Os、Pt等易挥发的元素，溶解样品时加入 0. 1%～ 1% HCl可以形成金属络合物，确保这些金属离子在溶液中稳定，降低或避免延迟效应和记忆效应。

对于汞记忆效应，引入Au元素也可起到与 HCl 类似的作用，Au的浓度通常在5～50 ppb。对于不溶于水的样品，可用有机溶剂进行溶解，常用的溶剂有二甲基甲酰胺(DMF)、2-丁氧基乙醇、二乙二醇单乙醚(DGME)、乙醇、异丙醇等，但是对于ICP-OES和ICP-MS而言，过多有机物进入系统内易导致雾化器和等离子矩管积碳、积盐，进而影响仪器灵敏度，因此尽可能不选用有机溶剂溶解或加入水尽可能降低有机溶剂的浓度。

直接溶解样品的方法简单、操作步骤少，减少了待测元素的损失，是液体制剂分析的首选。但是采用 ICP-OES或ICP-MS分析样品需考虑总固体溶解量(TDS)，一般控制在 1% 以下，TDS 太高易导致雾化器和炬管堵塞，也易造成基质效应。控制TDS最有效的方式就是降低分析时的样品浓度。

3.2.2 间接溶解法

对于原料药，一些辅料，如粘合剂、着色剂、颜料，以及难以找到合适溶剂溶解的制剂，这些物质很难采用直接溶解的方法制备样品，因此需要采用间接溶解法。间接溶解的关键是要确保样品完全溶解并且有较低的碳残留(RCC，或称有机物残留)，重要的是最终样品溶液的酸度应该与标准溶液保持一致，以保证基质尽可能一致，否则易造成样品分析时内标漂移。

间接溶解法包括敞开式消解法和密闭消解法，敞开式消解法易导致挥发性元素的损失，如 Hg、Os，因此更推荐用密闭消解法（即微波消解法）消解。微波消解法采用密闭的消解罐，避免了样品在消解过程中挥发性组分和元素的损失，也避免了外部环境的污染。

消解溶剂首选是用浓HNO3，因浓HNO3具有强氧化性，大多数药品仅用HNO3即可。对于有机物消解不完全的药品，可采用混合溶剂消解，如HNO3/H2O2(比例通常为2～10:1)，HNO3/H2SO4、HNO3 /HCl、HNO3 /HCl /H2O2。当样品中有二氧化硅(SiO2 )、二氧化钛(TiO2 )或者滑石粉(Mg3 Si4O10 (OH)2 )时，需加HF消解样品，HF的比例通常为HNO3的1/2或1/3。消解之后的样品一般用水进行稀释，但对于 Hg、Os 和 Pd等易挥发性元素，稀释时需额外加入稳定剂以保证结果的准确性，比如笔者通常加入0.5%～1%HCl或Au元素以稳定Hg元素；加入0. 01 mol /L硫脲、0. 1 g /L抗坏血酸和 0. 5% 乙酸以稳定Os元素。

间接溶解法，尤其是微波消解法很大程度上降低药品中有机物的含量，减少了雾化器、等离子体矩管、采样锥和截取锥的积碳、积盐，有助于降低基质效应，是原料药、难溶性辅料和固体制剂的首选。

3.3 分析技术选择

无机元素的分析技术有多种，包括常规的重金属检查法、紫外分光光度法（UV）、原子吸收分光光度法（AAS）、X射线荧光光谱法(XRF) 、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP－OES)和电感耦合等离子体质谱法(ICP－MS)。对于微量和痕量元素杂质而言，最主要采用ICP－OES和ICP－MS，其余的方法都有各自的缺陷，决定了其不适用于多种元素杂质的分析，表5清晰地展示了各种分析技术的优缺点。

▲ 表5-常见元素分析技术优缺点汇总

由上表可得，ICP－MS法凭借其众多优点，最适合进行多种元素杂质同时分析（尤其是痕量和超痕量杂质），所以此法已成为广大药研人进行元素杂质分析的首选。

ICP－MS法通常需要设置的关键参数有目标同位素、内标同位素、测试模式。目标同位素首选是自然界中丰度最高的同位素，但也需考虑到同质异位素、结合体（氧化物、氯化物等）的影响，如CO+易干扰28Si的测定，笔者测Si时倾向于选择29Si；ArCl+易干扰75As的测定，笔者测As时一般不在样品溶液中加入稀盐酸；ArO+易干扰56Fe的测定，笔者测Fe时倾向于选择57Fe……。内标同位素的选择原则是不可与目标同位素含有同种元素，尽量与目标同位素的质量数接近，通常相差不超过50 amu，因为质量数越接近，同位素的结构和性质越接近，电离能越接近，分析时的响应值就越接近，通常内标同位素的响应值不低于目标同位素的，若内标同位素响应值过低容易造成内标漂移从而失去校正作用，因此内标同位素的选择需综合质量数差异和响应值两方面考虑，比如笔者在做B元素分析时，一开始选择6Li作为内标时，其响应值仅有9000左右，而11B的响应值18000～90000，结果在测样品时，时不时有一针内标的响应值偏高或偏低，相比线性第一点变化达到20%（通常变化值在±10%说明内标稳定，按此标准6Li只能变化±900），而换成45Sc作为内标后，由于45Sc的响应值在140000左右，内标的变化值虽然最高增加5000，但也只变化了3.5%，因此45Sc作为内标非常稳定。测试模式通常分为两种：标准模式（无碰撞模式）和碰撞模式，标准模式适用于低质量数的元素，如7Li、9Be、11B等；而碰撞模式适用于大多数元素，尤其是易于形成结合体的元素，碰撞气的存在可将结合的两种或多种离子/原子分离，有效解决同质异位素的干扰。此外，碰撞模式下碰撞气流速也是一个关键参数，流速过低依然会存在结合体的干扰，流速过高易降低目标同位素和内标同位素的响应值，通常流速设为3～5 ml/min为宜。3.4 分析方法预验证

当确定了前处理方法和分析技术后，一套元素杂质分析方法也就初步开发建立而成了，在进行关键的分析方法验证之前，需进行简单的方法预验证，如部分验证和完全验证，以便及时发现分析方法中的问题，通常进行专属性、线性与范围、精密度、准确度这四项验证即可。当预验证结果符合要求（参考USP <233>和<1225>）后即为正式验证打下坚实基础。

04 分析方法验证项目

药物分析方法验证实施通常主要参考ICH Q2、USP <1225>以及ChP 9101，但在以上的指导原则基础上，元素杂质分析又有专门的指导原则，如USP <233>、EP 2.4.20，中国药典和欧美药典中也有关于ICP-OES和ICP-MS的通则，如USP <730>、EP 2.2.58.和ChP 0412，以下列表是各指南提及的验证项目和标准对比。

▲ 表5-各国元素分析方法验证参考指南对比

从上表可清晰得知，中国药典至今没有专门的元素杂质的分析方法指导原则，ChP 0412重点讲的是ICP-MS的构造、原理和测试方法，关于方法验证方面只提及了线性、检测限和定量限，USP和EP的指南无论在元素杂质指导原则还是ICP-MS通则中都详细描述了方法验证的各个项目的要求，参考价值显然更高，由于欧美药典在个别验证项目的要求略有不同，如定量限、重复性，因此笔者建议以注册申报为导向选择主要参考指南：若药品欲往欧盟申报，建议优先参考EP的指南；若药品欲往美国申报，建议优先参考USP的指南；若只是在国内申报或往其他国家申报，笔者建议优先参考USP的指南，因USP <233>和<730>几乎全面提及方法验证的项目，要求描述也最详细，是最具参考价值的，也是国内广大药研人进行元素杂质分析研究的首选。

05 总结

本文笔者将法规指南和个人经验有机结合，从查阅文献资料、确定元素种类和限度、方法开发、方法验证等方面全面描述了元素杂质分析方法开发和验证的要点，希望对广大同行有所帮助，不足之处敬请批评指正！PS：让我们共同期盼2025版《中国药典》收载元素杂质分析指导原则那一天到来！

参考文献

[1] 徐昕怡, 刘贞. 欧美药典及ICH元素杂质指导原则增修订历程及对中国药典的启示[J]. 中国药事, 2019, 33(6): 624-629.

[2] 朱俐, 赵瑜, 姚尚辰,等. 药物中元素杂质检测技术研究最新进展[J]. 分析测试学报, 2020, 39(4): 547-554.

[3] 李龙, 于军强, 于秀丽, 等. 地氯雷他定原料药中元素杂质的测定[J]. 食品与药品, 2018, 20(5): 352-354.

[4] USP 43-NF 38[S]. 2020.[5] EP 10.0[S]. 2019.

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