蛋白质印迹（Western blot）实验操作步骤
本文仅为我自己实验的一个流程记录，可能很多地方和大家都不太一样，仅供大家参考学习
1.提蛋白：
蛋白裂解液配方：
RIPA:1ml
PMSF:10μl
Cocktail:20μl
RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的PAGE、Western、免疫沉淀(immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。
RIPA裂解液(强)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。
PMSF:苯甲基磺酰氟是一种不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶等，、作用原理是特异性识别并磺化决定酶活性的丝氨酸残基活性位点。此外，其对半胱氨酸蛋白酶（如木瓜蛋白酶，DTT逆转其抑制活性）和哺乳动物来源的乙酰胆碱酯酶也有抑制效果。PMSF常在细胞或组织裂解之前加入到裂解液中以预防蛋白的降解。
Cocktail：蛋白酶抑制剂Cocktail是低毒，全面的蛋白保护试剂，最大限度地保护蛋白，使其免于被蛋白酶降解。目前生物学研究日渐深入，更多地将目标锁定为细胞中较为微量的蛋白，如信号通路蛋白、受体蛋白，采用coIP,Pull-down等方法获得样品。对于这些微量的珍贵样品，Cocktail能取得最佳的保护效果，比单一的抑制剂（如PMSF）更为可靠。
先把蛋白裂解液，EP管（做好标记）放在冰上预冷细胞培养皿也放在冰上
①4℃预冷离心机
②弃去细胞培养基
③PBS洗三次（贴壁细胞照常洗，悬浮细胞加PBS离心洗，尽量吸干净，避免稀释蛋白）
④加蛋白裂解液，10cm皿200μl，置于冰上
⑤细胞刮刀刮下细胞（悬浮细胞不需此步）
⑥转到1.5mlEP管中，冰上放置10-15分钟
⑦12000rmp，4℃离心15min
⑧取上清到EP管中
可放-80℃保存
2.BCA法测标准曲线
①蛋白标准品的准备
a.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。 配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。
b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl 25mg/ml蛋白标准，加入980μl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为 了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20℃长期保存。
②BCA工作液的配制
根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5mlBCA试剂A 加100μl BCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。 BCA工作液室温24小时内稳定。
③蛋白浓度检测
a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。（一般是先加PBS再加标准品，试剂先加多的，再加少的，也就是先按20、19、18、16、12、8、4、0μlH2O于96孔板的标准品孔中，再各加0、1、2、4、8、12、16、20μl标准品）
b.首先加19μlPBS到96孔板的样品孔中，再加入1μl 我们步骤一中提取的蛋白上清（设复孔）
c.各孔加入200μl BCA工 作液，37℃放置20-30分钟。
注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温 度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。
d.用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的波长的吸光度。
e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。根据标准曲线得到回归曲线，y为OD值，算出x样品的蛋白浓度为多少μg/μl
f.配置WB上样样品，如果要配一个500的体系，500μg需要加多少μl样本，多少μlH2O，这边我们是用4X的loadingbuffer，取125μl，配成500μl，就刚好稀释到1x的工作浓度
loadingbuffer是常用的电泳上样缓冲液，工作浓度是1X ，主要成分是1 M Tris-HCl（pH 6.8）、 十二烷基磺酸钠（SDS）、 溴酚蓝、 甘油 、DTT，其中甘油的作用是使样品沉到点样孔中而不漂浮起来；SDS是结合蛋白质，使所有蛋白质所带电荷性质一样，但不同分子量的蛋白结合的SDS数量是不一样的；溴酚蓝是指示剂，可以用来观察大概的电泳过程。DTT还原剂来让蛋白质充分变性，同时保护-SH基团内含还原剂破坏二硫键，而不会破坏蛋白质的一级结构，不影响WB检测，因为WB主要只是测蛋白表达量，而不需要蛋白的高级结构。
g.95℃煮5min，后可保存于-20℃，剩余样品放置于-80℃冰箱保存.
3.WB试剂配制
①配置1.5 mol/L Tris.HCL(PH 8.8)-----高压蒸汽灭菌
Tris base：72.68g
ddH2O：320ml
测量PH并定容至400ml
②配置1 mol/L Tris.HCL(PH 6.8)-----高压蒸汽灭菌
Tris base：18.54g
ddH2O：100ml
测量PH并加HCL(大约11ml)定容至150ml
③10XRunning Buffer（储存液）
Tris base：24.2g
甘氨酸：80g
SDS：10g
定容至1L，使用时，要稀释成1X工作浓度，即：900mlH2O+100ml10XRunning Buffer
④10X转膜缓冲液
Tris base：30.3g
甘氨酸：144g
定容至1L，使用时，要稀释成1X工作浓度，即：800mlH2O+100ml10X转膜缓冲液+100ml甲醇
⑤10xTBS（Tris缓冲盐水--洗膜时用）（储存液）（PH 6.8）
Tris base：24.2g
NaCl：80g
ddH2O：900ml
测量PH并加HCL(大约12ml)定容至1L，使用时，要稀释成1X工作浓度，即：900mlH2O+100ml10XTBS
TBST：含0.1%吐温-20的1XTBS，即：1ml吐温-20+1000ml的1XTBS
⑥配置分离胶与浓缩胶
注意：TEMED最后加，下图中8ml与15ml大约为两块1.5mm的板
4.SDS-PAGE电泳
①配胶前先将板子弄好（将玻璃板对齐后放入卡紧，小心放置玻璃片）
②分离胶配好加入板子中
③加入ddH2O（异丙醇也可以）封闭（加满），室温放置15-20min后倒掉水，用剪好的滤纸条吸干水
④浓缩胶配好加入板子中（浓缩胶分离胶可以同时配置，但浓缩胶用时再加TEMED）
⑤插梳子（沿着一边插，尽量避免气泡）室温放置20-30分钟后放入电泳槽，并往内槽中注满电泳液
⑥拔梳子：缓慢垂直拔（如遇孔内堵塞，可用枪头吹吸或针头挑，若孔内胶条歪了，用针头挑正）
⑦缓慢加入样本20μl （注意样本顺序）最左侧加marker4μl ，最右侧加marker2ul
⑧补充足够电泳液后开始电泳（外槽页面需超过金属丝）电泳液可回收两次
⑨浓缩胶电压约80V 30min
分离胶120V，根据目的蛋白的大小来判断时间
5.转膜
①准备2张的滤纸和2张8.5cm x 6cm的PVDF膜（或NC膜），切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的PVDF膜用甲醇浸泡2-3min，颜色有变化（或下沉）即可转移至转膜液中浸泡。（甲醇可以倒入后续的转膜液中）
②在加有转膜液的搪瓷盘里按照“三明治”结构组装转膜夹
三明治结构：黑板-海绵垫-滤纸-胶--PVDF膜-滤纸-海绵垫-白板（黑胶白膜）
注意胶与膜之间不能有气泡
③将“三明治”放入转膜装置（黑对黑，白对红）（注意膜的正反）
④倒入4℃预冷的转膜液（现配现用，防止甲醇挥发），放入冰盒，在冰盒中转膜
150mA 2h（20kD~55kD）——200mA 1h15min
⑤转完后将膜用1×TBST 在摇床上摇动洗涤5min（注意正反面，右上角剪一点）
⑥封闭：5%脱脂牛奶常温封闭1h（或用5%BSA：磷酸化蛋白常用BSA封闭）
⑦用1×TBST 在摇床上摇动洗涤5min，根据目的条带大小剪去膜条进行后续免疫反应
6.免疫反应
①将一抗用TBST（或牛奶或BSA）稀释至适当的浓度，将所测的蛋白区段条带放到孵育盒里，加入稀释好的抗体4℃摇床过夜孵育（60速）。注：一抗内参常用beta-actin或beta-Tubulin，GAPDH易受影响，内参常按1：4000稀释；一抗常按1：2000稀释
②将条带从一抗中取出，放到TBST中摇床洗涤3次，10min/次
③使用相应的二抗，将二抗用TBST稀释至适当的浓度，将所测的蛋白区段条带放到孵育盒里，加入稀释好的抗体摇床孵育2-3h（二抗常按1：4000稀释）
④将条带从二抗中取出，放到TBST中摇床洗涤3次，10min/次
7.化学发光显影
8.时间安排
第一天：配各种液+配胶
第二天：上样+电泳+转膜+孵一抗过夜
第三天：孵二抗+洗二抗+显影
