2023.7.17华中农业大学全英文选修课程生物技术中的微生物学课程第六节课程要点

关于一节关于CRISPR Cas9系统的课程内容，老师介绍了一些基本概念和技术。首先，老师回顾了上次课讲的同源重组和它的优点，例如它是位点特异性的，并且可以在没有限制性酶的情况下构建大型插入物。但是，同源重组在某些生物中效率较低，如哺乳动物和高等真核生物。然后老师介绍了CRISPR Cas9系统，这是一种高效的位点特异性修饰技术，它可以用于几乎所有生物。CRISPR Cas9系统中的CRISPR是“clustered regularly interspaced palindromic repeats”的缩写，它是一种在原核生物和真核生物中都存在的保守机制。老师还解释了如何通过测序和BLAST寻找重复序列，以及如何识别回文序列。

介绍了CRISPR基因编辑技术的起源和原理。CRISPR是一种免疫途径，最初是为了帮助原核生物抵御病毒而发现的。CRISPR是由三个主要组成部分组成的：CRISPR RNA，tracer RNA和Cas9蛋白。CRISPR RNA是一种与病毒匹配的RNA序列，tracer RNA是一个不被翻译成蛋白质的RNA序列，但它能够与Cas9蛋白结合，并将其与CRISPR RNA粘合在一起。Cas9蛋白是一种内切酶，可以切割DNA，用于编辑基因。通过这种方式，CRISPR技术能够使科学家精确地编辑DNA序列，以治疗疾病、改善农业等方面发挥重大作用。

讲述了CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）系统的功能和应用。CRISPR是一种天然的细菌免疫系统，可以保护细菌免受病毒感染。它由蛋白质和RNA组成的复合物（RNP）组成。RNP通过匹配病毒基因组的序列来切割病毒基因组，以保护细菌免受病毒感染。在自然环境中，细菌会将病毒基因组的一小段整合到它们自己的基因组中，以便在将来遇到同样的病毒时更好地保护自己。

在生物技术中，CRISPR系统被改造用于基因编辑和基因治疗。科学家Jennifer Doudna领导的团队发明了一种名为“guide RNA”的新型RNA，可以指导Cas9蛋白质切割指定的DNA序列。通过改变guide RNA的序列，人们可以选择性地切割和编辑基因。这种技术有望在基因治疗和农业领域发挥重要作用。

讲述了CRISPR系统的生物技术进展。首先介绍了CRISPR Cas9系统可以通过修改guide RNA来实现在DNA中精准切割任何需要切割的基因。同时，科学家们还通过将核定位信号添加到CRISPR Cas9中，使其能够进入真核细胞核内切割DNA，这是第一次成功修改真核细胞的尝试。其次，文本介绍了CRISPR在基因组编辑中的应用，包括如何通过两种方式——非同源端连接和同源重组——修复切割的DNA。此外，文本还强调了CRISPR系统的编辑过程比人们想象的要复杂得多。

讲述了利用CRISPR Cas9技术进行基因编辑的过程以及两种不同的基因敲除方式。在进行基因编辑时，需要进行同源重组来修复基因，因此需要两个同源序列。而进行基因敲除时，可以使用两种方式，一种是直接切断基因，另一种是在多个位置切割基因，以达到完全删除的目的。在进行基因编辑时，需要使用Cass 9和一个匹配Gnax的引导RNA，以及一个含有Gnax和His tag的质粒。同时，文章还介绍了CRISPR Cas9技术中的multiplexing的概念，即在多个位置同时切割基因，以提高效率。

讲述了CRISPR技术如何通过homologous recombination实现基因编辑，以及如何在人类细胞培养中应用CRISPR技术进行基因编辑。使用CRISPR技术进行基因编辑时，需要提供一个template来实现homologous recombination，CRISPR只是负责切断基因，并需要提供一个template来进行编辑。在进行CRISPR基因编辑时，需要将RNP（包括CAST9和guide RNA）送入细胞中，可以通过转染或微注射等方式实现。在这个过程中，通常会使用两种质粒，第一个质粒含有CAST9基因，第二个质粒含有guide RNA基因，以及一些启动子和诱导子等辅助元素。此外，还可以通过制备RNP的方法将CAST9和guide RNA从细胞中提取出来，然后混合在一起进行编辑。最后，在进行CRISPR基因编辑时，需要进行细胞培养，通常使用细胞培养瓶和适当的培养基来进行。

讲述了基因编辑的多种方法和如何验证编辑是否成功的过程。其中，可以通过 RNP、转基因插入等方式将 Cas9 递送到细胞中进行基因编辑，然后通过 PCR 和电泳实验验证是否成功。如果是插入，需要设计合适的引物。整个过程中，基因编辑只是第一步，验证编辑是否成功同样重要。

CRISPR和agrobacterium在生物技术中的应用。在讨论CRISPR时，重点讨论了如何验证和解决CRISPR在基因编辑中的问题，包括验证基因编辑是否成功、CRISPR的局限性和潜在的off-target效应。在讨论agrobacterium时，重点讨论了为什么需要制造转基因植物以及agrobacterium在制造转基因植物中的应用。其中，制造杀虫植物和黄金大米是转基因植物的两个主要应用场景。

利用农杆菌是插入转基因的最常见方法之一，因为农杆菌可以将DNA插入植物细胞中。农杆菌是一种革兰氏阴性菌，具有两个薄的细胞膜和细胞壁。农杆菌是一种植物病原菌，可以导致植物形成肿瘤（也称为galls）。农杆菌有一个特殊的质粒，称为ti质粒，其中包含了一些vera基因，这些基因编码了一个分泌系统，可以将细胞内的DNA和蛋白质分泌到细胞外，导致植物感染。Vera基因之所以被称为vera基因，是因为它们编码的蛋白质可以使植物发生变异，即产生病变的现象。ti质粒还有其他一些基因，包括Aux/IAA和ARF基因，这些基因可以调节植物激素的合成和信号转导，从而影响植物的生长和发育。讲述了植物农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的T-DNA转移技术，这是一种用于生物技术的重要工具。农杆菌带有一种称为Ti质粒的DNA分子，其中包含一个T-DNA区域，它可以被细菌转移至寄主植物细胞，并插入到植物染色体中，导致发生瘤形成。在农杆菌中，VIR蛋白质可以帮助T-DNA转移。为了将目标基因X导入植物，可以将基因X插入到T-DNA区域中，并使用农杆菌T-DNA转移技术将其传递到植物细胞中。这个过程需要使用两个质粒：一个是带有T-DNA区域的质粒，另一个是带有VIR基因的助质粒。将这两个质粒共同投入到农杆菌中，再将其接种到植物上，就可以实现目标基因的转移。从植物细胞的再生到如何选择转基因植物，再到介绍农杆菌转基因的优缺点，以及Bt细菌的发现和生命周期。其中，农杆菌介导转基因的过程利用了其自身的T-DNA片段，通过插入选择标记进行筛选。Bt细菌最初是由一位德国谷物学家发现的，他发现某些谷物中有害虫并研究了这些有害虫的生命周期，最终发现了Bt细菌并将其用于杀虫。

生命周期：介绍了一种名为BT（巴基杆菌）的细菌，它可以通过在幼虫的肠道内形成蛋白晶体来杀死昆虫，从而保护植物免受昆虫侵害。BT的晶体在昆虫肠道中溶解，然后通过破坏肠道细胞膜进入昆虫体内杀死昆虫。细菌形成孢子，这些孢子中包含有晶体，使其可以在昆虫出现之前长期存活。BT与植物之间可能存在共生关系，从而保护植物免受昆虫侵害。

机制：BT的晶体形成在其cry基因的c末端，由该基因的n末端的受体结合域和c末端的cry结构域组成。这些晶体在碱性的昆虫肠道中被溶解，cry受体结合域与细胞蛋白cadherin结合，进入细胞膜并打开孔隙，细胞死亡，BT进入昆虫体内杀死昆虫。

特点：BT在农业中应用广泛，因为它可以精确杀死目标昆虫而不会损害植物或人类健康。

Bt杀虫剂非常有效，能够针对特定种类的昆虫进行杀灭。这是因为Bt杀虫剂所含的cry蛋白是针对特定昆虫的，因为不同昆虫的Cadherin蛋白序列不同，cry蛋白只能与特定种类的Cadherin蛋白相互作用。这也是为什么Bt杀虫剂很受欢迎的原因之一。此外，这些句子还讨论了Bt杀虫剂抗性的发展机制，最常见的机制包括靶标位点抗性、ABC转运蛋白突变和蛋白酶Tripsin的突变，这些突变都可能导致Bt杀虫剂失去效果。

介绍了昆虫如何通过突变或基因敲除来抵抗杀虫剂。其中，靶标位点抵抗是一种常见的抵抗机制，而行为抵抗则是另一种类型的抵抗。

接下来，介绍了使用Bt（Bacillus thuringiensis）基因的转基因玉米生产的过程。这是生物技术领域中最著名的例子之一，通过将Bt基因插入玉米中，使得昆虫食用后会死亡。

然而，昆虫抵抗Bt玉米的情况也越来越普遍。为了减少抗性的发生，人们采用了一些策略，如金字塔策略和避难策略。金字塔策略是指将多个Bt基因插入转基因植物中，以防止昆虫演化出对其中一个基因的抵抗力。避难策略则是在转基因玉米和野生玉米之间留出一定比例的野生玉米，以便使得没有接触到Bt基因的昆虫能够存活下来。在种植转基因作物时，如果只种植一种抗虫品种，会导致虫害产生抗性，从而影响作物产量。因此，使用“庇护”策略，即在农田中种植10%的野生型作物，使部分虫害无法被抗虫作物杀死，从而减缓虫害产生抗性的速度。ABC转运蛋白是一种细胞膜蛋白，它能够将蛋白质运进或运出细胞。在转基因作物中，ABC转运蛋白与抗虫蛋白Cry结合，将其带入细胞膜并打开孔洞，使细胞破裂死亡。Cry蛋白有两个部分，RBSD和Cry区域，其中RBSD结合ABC转运蛋白，Cry区域则呈结晶态。此外，如果有问题可以向老师提问，老师会在测试中给予额外的分数。