文献解读｜高分辨单细胞图谱揭示非小细胞肺癌中性粒细胞多样性和可塑性

导语

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种高度侵袭性和异质性的疾病，具有不同的组织学亚型和不同的突变特征。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步使得能够在不同阶段对复杂的NSCLC肿瘤微环境（TME）进行剖析。然而，这些研究的一个主要限制是每个研究分析的患者样本数量有限。此外，由于缺乏基因组数据以及长期随访数据，无法全面分析生物异质性及其对治疗抵抗和生存结果的潜在贡献。

中性粒细胞是促肿瘤和抗肿瘤炎症途径的重要介质，包括中性粒细胞限制淋巴细胞向恶性肿瘤的转运，从而限制程序性细胞死亡1（PD-1）抑制的效力。非小细胞肺癌患者的相关研究已将中性粒细胞与淋巴细胞比率与临床结果和免疫治疗反应联系起来。此外，临床前证据强烈支持使用中性粒细胞耗竭剂（如CXCR2拮抗剂）作为免疫检查点抑制剂的佐剂。

研究结果

1. 构建核心大规模NSCLC单细胞图谱

我们首先通过汇编来自19项研究和21个数据集的scRNA-seq数据构建核心NSCLC图谱。样本：298名患者的505个样本（图1A）。核心图谱总共包括来自212名NSCLC患者和86名对照个体的转录组学数据，包括196个肿瘤样本和168个非肿瘤对照样本。在212例NSCLC患者中，156例在组织病理学上被注释为肺腺癌（LUAD），41例被注释为肺鳞状细胞癌（LUSC），15例未另行指定（NSCLC NOS）。NSCLC样本包括原发性肿瘤（n = 176）或转移（n = 45）的组织。将NSCLC患者的疾病分期分为早期（UICC I-II期）与晚期（UICC III-IV）疾病。对照样本中，89份来自肺部肿瘤患者的远处非恶性组织，其中65份具有患者匹配的肿瘤样本。此外，10份样本来自NSCLC患者的非肿瘤影响淋巴结，79份样本来自没有明显肺癌病史的患者。在对照患者中，18例有慢性阻塞性肺病（COPD）病史。

核心图谱整合了 898，422 个单细胞，注释为 12 个粗细胞类型身份和 44 个主要细胞亚型，包括 169，223 个上皮细胞、670，409 个免疫细胞和 58，790 个基质和内皮细胞。癌细胞分了以下主要集群LUSC（KRT5、KRT6A、KRT17、SOX2、NTRK2、TP63）；LUAD（CD24、MUC1、KRT7、NAPSA、NKX2-1、MSLN）；具有上皮到间质转化（LUAD EMT）迹象的LUAD（VIM、SERPINE1、CDH1、MIF）；具有神经内分泌特征的LUAD（LUAD NE）（CHGA、SYP、NCAM1、TUBA1A）；与EMT和转移（LUAD MSLN）相关的间皮素（MSLN）高表达的LUAD；以及表达LUAD和LUSC标记物的NSCLC（MUC1、KRT7、KRT6A、SOX2）（图1B）。将原发性肿瘤组织中的LUSC和LUAD中的细胞组成与作为参考细胞类型的癌细胞进行比较时，作者发现LUSC中的中性粒细胞比例显著较高，而LUAD中巨噬细胞、CD4+T细胞更丰富（图1F）。与晚期NSCLC肿瘤相比，早期的细胞类型组成分析显示早期cDC2的丰度更高。为了验证这一发现，对110名NSCLC患者（55名LUAD和55名LUSC）进行了正交验证，并对中性粒细胞、CD4+T细胞和巨噬细胞进行了免疫组织化学染色。结果证实了这些发现（图1G）。

2. TME的单细胞组成揭示了不同的NSCLC肿瘤免疫表型

使用扩展图谱根据TME的浸润模式对NSCLC患者进行分层。批量校正细胞类型组分的无监督聚类显示了四种不同的肿瘤免疫表型（图2A）：（1）免疫缺失（ID）肿瘤（没有显著的免疫细胞浸润，但癌细胞组分较高）；（2） 具有B细胞优势的肿瘤亚型（B；B细胞、浆细胞、肥大细胞）；（3） 具有髓系优势的肿瘤亚型（M；巨噬细胞/单核细胞）；和（4）具有T细胞优势的肿瘤亚型（T；CD8+、CD4+、T调节细胞）。分析了四种免疫表型中每一种的癌细胞中差异富集的途径。ID亚型显示雄激素途径显著下调（图2B）。应用CytoSig36工具来定义每种免疫表型癌细胞中富集的细胞因子信号特征(图2C)。ID组中的大多数细胞因子信号下调，IL-4显著升高(图2C)。髓系亚群中I–III型干扰素信号显著上调，表明巨噬细胞/单核细胞在TME中的干扰素信号传导的重要性(图2C)。

3. 细胞间通讯的分析揭示了TME中的异质细胞串扰

使用CellPhoneDB配体-受体复合物数据库，接下来通过分析前10个差异表达的癌细胞配体（图3A），评估了两种主要组织类型LUAD和LUSC中癌细胞对不同免疫细胞的串扰的差异。在LUAD中，我们发现从癌细胞到中性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞、肥大细胞和经典树突状细胞（cDC）的KDR-VEGFA轴显著上调，这可能与该组织类型中癌细胞的免疫抑制信号有关，与迁移和入侵有关。相反，在LUSC癌细胞中，存在前迁移SPP1信号的上调，该信号先前被报道为在肺癌组织尤其是鳞状组织中上调，以及Jagged1（JAG1）的上调，其诱导NOTCH，从而通过例如中性粒细胞募集促进肿瘤进展并调节肿瘤免疫微环境。通过分析差异表达的癌细胞配体，研究了患者免疫亚群T细胞、B细胞、髓细胞和ID中癌细胞与免疫细胞的串扰（图3B）。虽然在ID亚群中表达下调，但B、M和较少的T细胞亚群显示几种趋化因子（CXCL9/10/11、CCL3/13/18）向T和髓细胞亚群上的同源受体的信号转导上调，这表明癌细胞分泌的趋化因子梯度有助于免疫浸润。

4. TRN在TME中获得新属性

TRN分为肿瘤相关中性粒细胞 （TAN） 和正常相邻相关中性粒细胞 （NAN）。TANs是一种非常异质的细胞群体，具有抗肿瘤和促肿瘤特性。使用扩展图谱表征了NSCLC中TAN和NAN的转录组特征（图5A和5B）。与LUAD患者相比，LUSC患者的中性粒细胞更丰富，通过流式细胞术分析（图5C）也可以看到。总体TAN表型的特征在于OLR1（LOX-1）、VEGFA、CD83、ICAM1和CXCR4的高表达以及CXCR1、CXCR2、PTGS2、SELL（CD62L）、CSF3R和FCGR3B（CD16B）的低表达（图5D）。图谱提供了中性粒细胞是NSCLC TME中VEGFA表达的主要来源的证据（图5E）。主要关注的高度差异表达的TAN标志物是由OLR1基因为氧化低密度脂蛋白（LDL）的主要受体（图5D）。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）（OLR1的核受体和直接转录调节因子）在TAN中升高（图5F）。对NSCLC患者组织的流式细胞术分析证实了TAN中LOX-1（OLR1）的表达升高（图5G）。

5. TRN的可塑性和非规范功能性

在所有图集中性粒细胞（n=19166），分离了四个TAN亚群（TAN-1至TAN-4）和三个NAN亚集（NAN-1至NAN-3）（图6A）。标记基因选择揭示了簇之间广泛的表型异质性，并允许识别每个亚簇的标记基因（图6B）。NAN-1基因包括S100A12、NETosis共因子PADI4以及促血管生成标志物（PROK2、MMP9）。NAN-2簇与NAN-1簇非常相似，但显示一些NAN-1特异性基因（例如S100A12、PADI4、MMP9）的表达减少。NAN-3显示干扰素刺激基因（GBP1、GBP5、IFIT2）的强表达（图6B）。TAN-1显示IL1RN的高表达，其负调节IL-8分泌以控制过度的中性粒细胞炎症活性，以及有效的NF-κB激活剂RIPK271和CD44，调节细胞募集和粘附（图6B）。TAN-2亚群的特征在于主要（MHC）II类基因HLA-DRA、CD74、HLA-DMB和HLA-DRB1的表达，表明其表型具有免疫原性抗原呈递特征。CD74和HLA-DRA也在其他TAN簇中表达，尽管表达水平较低（图6B）。TAN-3亚群的特点是促炎细胞因子（C15orf48、CCL3、CCL4、CSTB）和LGALS3的高表达，这与中性粒细胞活化和迁移有关（图6B）。最后，TAN-4显示出核糖体基因（如RPS12、RPL3、RPN2、RPL23）的高表达（图6B），类似于严重COVID-19患者中发现的中性粒细胞簇。RNA速率分析，表明从NAN-3向NAN-2和NAN-1的转变。NAN-3和NAN-2分别转变为TAN-2和TAN-1，TAN-1和TAN-2转变为所有TAN亚型（图6D）。通过分析每个亚群的差异表达的TRN配体，研究了TRN亚群与CD8+T细胞和癌细胞的细胞相互作用，揭示了NAN与TAN的不同信号（图6F）。在所有TAN亚群中，发现VEGFA向癌细胞发出信号，再次强调了其重要的促血管生成作用，以及SPP1信号，这与免疫抑制TME和促迁移效应相关。

参考文献：

Zilionis R, Engblom C, Pfirschke C, Savova V, Zemmour D, Saatcioglu HD, Krishnan I, Maroni G, Meyerovitz CV, Kerwin CM, Choi S, Richards WG, De Rienzo A, Tenen DG, Bueno R, Levantini E, Pittet MJ, Klein AM. Single-Cell Transcriptomics of Human and Mouse Lung Cancers Reveals Conserved Myeloid Populations across Individuals and Species. Immunity. 2019 May 21;50(5):1317-1334.e10. doi: 10.1016/j.immuni.2019.03.009. Epub 2019 Apr 9. PMID: 30979687; PMCID: PMC6620049.