项目文章丨单细胞测序解析发育中人脑小胶质细胞的区域规范和状态转换的时空动态

2022年3月3日，北京博奥晶典生物技术有限公司合作中国科学院动物研究所焦建伟、北京大学杜鹏、中国科学院动物研究所王雁玲、北京大学靳蕾等研究人员在 Cell Stem Cell（IF: 24.633）发表发育中的人类大脑不同区域的小胶质细胞的最新研究成果“Decoding the temporal and regional specification of microglia in the developing human brain”。该研究分析了来自发育中的人类大脑不同区域的小胶质细胞的单细胞转录组，并结合实验验证，定义和表征了与区域规范和状态转换相关的早期小胶质细胞命运决定。本研究中 10x Genomics 单细胞转录组测序由博奥晶典提供。

【发表期刊】Cell Stem Cell

【发布时间】2022年3月

【影响因子】24.633

【发表单位】中国科学院动物研究所&北京大学

研究背景

作为中枢神经系统（CNS）的先天免疫细胞，小胶质细胞在免疫、监视和保护健康的 CNS 方面发挥着重要作用。小胶质细胞的区域相关异质性和状态转换（静息状态到激活状态）对大脑发育和神经发病机制很重要，然而这一机制目前尚不清楚。因此，有必要充分表征和理解在早期大脑发育过程中伴随着小胶质细胞区域规范的发育命运决定和状态转变。

研究思路

主要结果

1、scRNA-seq 构建人胚胎脑不同区域小胶质细胞的单细胞转录组图谱

研究对人胚胎 Carnegie Stage（CS）12卵黄囊 及头部组织、不同孕周（GW8-GW23）胚胎脑不同解剖位置（大脑、间脑、中脑、小脑）进行消化，后分选分选 CD45+CD33+ 细胞进行 10x Genomics 单细胞转录组测序，共获得 12565 个胚胎小胶质细胞，20个 cluster 定义为 4 大类细胞类型：起源、增殖、免疫应答和神经元基因富集相关的小胶质细胞，并对四大类小胶质细胞进行分子表达特征分析（图1）。

2、小胶质细胞区域规范的不同发育轨迹分析

为了可视化和重塑来自 CS12 的同一组原始骨髓祖细胞的神经元基因富集和免疫相关小胶质细胞的细胞命运决定轨迹，研究人员对来自四个单独大脑区域的小胶质细胞进行 Monocle2 分析，对来自整个大脑的细胞进行 URD 分析，都显示出相似的结果：源自 CS12 卵黄囊和头部 的小胶质细胞祖细胞首先启动细胞增殖，在不同的细胞周期阶段，然后这些增殖小胶质细胞向两种不同的细胞命运转变：免疫或神经元基因富集特征（图2）。

3、胚胎皮层发育过程中小胶质细胞的状态转换

为了更精确地解码胎儿中枢神经系统早期发育过程中小胶质细胞的状态转换，研究人员收集共计7例不同孕周（GW8-GW23）的人胚胎皮层组织，消化后流式分选 CD45intCD11Bpos 细胞进行 10x Genomics 单细胞转录测序，共获得 25891 个小胶质细胞，构建了人类发育中的大脑皮层小胶质细胞单细胞转录图谱。研究人员使用免疫荧光染色实验验证并证实这些新发现的 cluster 出现在不同的大脑发育阶段（图3）。

4、发育中小胶质细胞的状态转变在人和小鼠的保守性分析

研究人员收集胚胎小鼠 E8.5 卵黄囊（第 8.5 天）、E9.5 胚胎小鼠的头部和 E10.5-P20 发育中的小鼠大脑的皮层区域（Cor）组织，进行消化，并分选纯化 Cd45intCd11bpos 骨髓细胞，进行 10x Genomics 单细胞转录组测序，共获得 41415 个细胞。通过描绘人和小鼠小胶质细胞发育不同阶段相关性的热图发现人类和小鼠小胶质细胞发育过程中静息/活跃状态转换存在保守性，并用小提琴图展示了人和小鼠小胶质细胞中典型小胶质细胞基因和激活基因的表达趋势，及巨噬细胞相关基因的表达趋势（图4）。

5、人和小鼠小胶质细胞分子特征的差异分析

接下来，研究人员分析了人类（CS12-YS 和 CS12-Head）和小鼠（E8.5-YS、E9.5-Head 和 E10.5）小胶质细胞起源相关样本中的 DEG 的热图，发现人类 CS12-Head 在转录组水平上与小鼠 E10.5 最相似。此外，人类（GW8-GW23）和小鼠（E13.5-P20）大脑皮层样本使用 Seurat 或 LIGER 分析，均发现人和小鼠的大多数细胞类型都可以合并在一起，表明人类和小鼠的几种细胞类型和发育途径是保守的，但人和小鼠小胶质细胞分子特征存在差异。首先是物种特异性基因的表达：人类有 139 个高表达基因，小鼠中有 98 个高度富集的基因。其次是功能亚类的差异：人类有 638 个富集的基因，小鼠中有 597 个上调基因；GSEA表明，与小鼠相比，人类细胞的粘附分数、细胞因子相互作用、MAPK 信号通路和 Toll 样信号通路均富集（图5）。

全文亮点

1

构建了来自不同脑区的人类小胶质细胞的单细胞转录组图谱；

2

研究发现神经元基因富集的小胶质细胞在早期 CNS 发育中动态出现；

3

研究发现免疫相关小胶质细胞在中间阶段后区域特化；

4

进行了跨物种的人和小鼠小胶质细胞的比较。

总之，该研究分析了来自发育中的人类大脑不同区域的小胶质细胞的单细胞转录组，并结合实验验证，定义和表征了与区域规范和状态转换相关的早期小胶质细胞命运决定。这些发现将为研究小胶质细胞正常功能及相关疾病机理研究提供重要的理论基础。

参考文献LiY, Li Z, Yang M, Wang F, Zhang Y, Li R, Li Q, Gong Y, Wang B, Fan B, Wang C, Chen L, Li H, Ong J, Teng Z, Jin L, Wang YL, Du P, Jiao J. Decoding the temporal and regional specification of microglia in the developing human brain. Cell Stem Cell. 2022 Feb 17: S1934-5909(22)00055-8. doi:10.1016/j.stem.2022.02.004. Epub ahead of print. PMID: 35245443.