泛素化相关的FANCI S/TQ簇磷酸化促进FANCI/D2复合物的激活

写在前面

        今天推荐的是由西雅图弗雷德·哈金森癌症研究中心团队在2017年6月20日发表于Cell Reports（IF:7.985，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Toshiyasu Taniguchi教授，研究表明泛素化相关的FANCI磷酸化可完全激活FANCI/D2复合物并使其无需去泛素化即可发挥作用。

研究背景

        Fanconi贫血（FA）是一种遗传性疾病，其特征是骨髓衰竭、易患癌症以及细胞对DNA链间交联（ICLs）敏感。FA通路的功能依赖于FA核心复合物催化的FANCD2单泛素化。这种修饰使FANCD2定位于DNA损伤部位并协调修复ICLs。另一方面，USP1对FANCD2的去泛素化也是FA通路所必需的。

        先前的研究表明，ATR介导FANCI上6个位点（S/TQ簇结构域内）的磷酸化从而促进FANCI/D2的单泛素化。现有模型认为FANCI磷酸化是一个上游事件，其发生在FANCI/D2单泛素化之前。先前的研究很少考虑这种磷酸化是否在FA通路中起其他作用。此外，DNA损伤后具体哪一个FANCI的S/TQ簇位点被磷酸化还知之甚少。

摘要部分

        本研究中，作者制备了针对hFANCI上三个不同S/TQ簇位点（S556、S559和S565）的磷酸化特异性抗体。作者发现，某些FANCI位点（S559和S565）的磷酸化与FANCI的单泛素化有关，这与现有模型不同。本研究认为泛素化相关的FANCI磷酸化作用于FANCI/D2单泛素化的下游，可在不破坏FA通路功能的情况下维持FANCD2的单泛素化。此外，USP1的缺失虽然增加了FANCI/D2的单泛素化水平，但抑制了泛素化相关的FANCI磷酸化。

研究内容

1.抗hFANCI上S/TQ簇位点的磷酸化特异性抗体的鉴定     

        作者通过质谱分析发现hFANCI中S/TQ簇的两个位点S556和S565在本实验条件下被磷酸化。因此作者制备了特异性检测这两个位点磷酸化的抗体，还生产了一种针对S559磷酸化的特异性抗体。

        这些抗体可用于检测U2OS细胞中三个FANCI磷酸化位点中的每一个在MMC刺激下的ATR依赖性磷酸化。作者证实了在S556、S559或S565磷酸化的破坏性突变导致相关信号丢失，表明每个磷酸化抗体都具有位点特异性。

研究结论：hFANCI的S/TQ簇中至少有三个位点以ATR依赖的方式响应ICLs而被磷酸化。

2. FANCI磷酸化与FANCI/D2单泛素化在细胞周期进程中共同调控

        接下来，作者分析了在双胸苷或诺可达唑处理后，U2OS细胞在不同时间点的FANCI磷酸化。与FANCI磷酸化调控FANCD2单泛素化的报道一致，当已知FANCD2单泛素化发生时，所有三个位点在S期均发生磷酸化。

        在细胞分级分离实验中，作者发现MMC处理的U2OS细胞沉淀（含染色质）中S556、S559和S565的磷酸化显著增加。这表明大多数FANCI磷酸化发生在与染色质结合的FANCI上。

研究结论：FANCI磷酸化不仅在外源DNA损伤反应中起作用，而且在正常的细胞周期进程中也起作用。

3.FANCI中S/TQ簇的泛素化非依赖性和泛素化相关的磷酸化     

        作者之前观察到S556磷酸化主要在非泛素化的FANCI上检测到，相比之下，S559和S565磷酸化主要在单泛素化的FANCI上检测到。作者还观察到原代人类包皮成纤维细胞中S556和S565的磷酸化差异。     

        进一步研究发现，MMC诱导非泛素化FANCI的S556磷酸化可在缺乏FA核心复合物时发生。然而，非泛素化FANCI上S559/S565的磷酸化部分或完全受损。一系列的研究表明，只有当FANCI和FANCD2是单泛素化状态时，FANCI在S559/S565才能发生最佳磷酸化。

        实验显示，MMC处理后，所有三个位点都对FANCD2的单泛素化起正调控作用。每个位点磷酸化的破坏性突变抑制了FANCD2单泛素化，而类磷酸化突变增加了FANCD2单泛素化。

研究结论：FANCI中S/TQ簇的非泛素化依赖（S556）和泛素化相关的（S559/S565）磷酸化位点对FANCD2单泛素化起正向调控作用。

4.USP1是泛素化相关的FANCI磷酸化所必需的

        实验显示，即使没有MMC处理，USP1的缺失也会导致U2OS细胞中FANCI和FANCD2的单泛素化增加。然而，未处理情况下积累的单泛素化FANCI在相关位点没有发生磷酸化。此外，与对照细胞相比，在MMC处理后USP1缺失细胞中泛素相关的FANCI磷酸化减少了。研究表明，USP1的去泛素活性是这些位点的磷酸化所必需的。

研究结论：抑制USP1增加了FANCI/D2的单泛素化，这与泛素化相关的FANCI磷酸化被抑制有关。

5.泛素化相关的FANCI拟磷酸化使FA通路无需FANCD2的去泛素化便能发挥功能     

        研究表明S559/S565磷酸化在抑制FANCD2的去泛素化中起作用。作者发现，在U2OS细胞中加入ATR抑制剂时，FANCI和FANCD2都迅速去泛素化，这种去泛素化与S559和S565的逐渐去磷酸化有关。     

        实验显示，S559D-S565D FANCI对FANCD2单泛素化的影响与USP1敲低或被抑制相似。此外，S559D-S565D FANCI在停用MMC到加入ATR抑制剂后强烈延缓了FANCD2的去泛素化。     

        研究表明，在USP1缺乏或被抑制时，FANCD2去泛素化受抑制是FA通路功能不良的原因。此外，不能被去泛素化的FANCD2-泛素融合蛋白修复ICL的能力受损。

        与先前的研究一致，USP1抑制剂（ML323）的处理使细胞对MMC敏感。另外，作者观察到的USP1被抑制时ICL修复的受阻可能是另一种机制的影响。

研究结论：泛素化相关的FANCI位点的持续磷酸化能够避开FANCD2的去泛素化使FA通路发挥功能，并缓和USP1被抑制时细胞对MMC的敏感性。

结论与讨论

        研究表明，激活的FANCI/D2复合物不仅是单泛素化的，还有以泛素化相关的方式磷酸化的。作者的工作构建了一个关于FANCI磷酸化如何激活FANCI/D2复合物的精细模型。泛素化相关的FANCl磷酸化导致FANCD2单泛素化的增加，这在功能上以及疾病治疗方面具有一定意义。

Thank you!

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.05.081