动物实验AAV感染指南——肾脏篇
上期我们介绍了感染肠道的常见注射方法,本期主要介绍感染肾脏的常用注射方法。系统性给药感染肾脏的效率较低，因此研究人员开发了多种肾脏局部注射的方法，包括肾动脉注射、肾静脉注射、经输尿管肾盂逆行注射、肾实质注射和肾盂注射。本次将详细介绍这五种注射方法，部分注射方法有附上视频教程链接哦，小伙伴可直接将网址复制到浏览器中观看学习~
图1 肾脏注射方法示意图[1]
A：肾动脉注射；B：肾静脉注射；C：经输尿管肾盂逆行注射；D：肾实质注射
肾动脉注射操作步骤[2]
（1）4%异氟醚麻醉大鼠，皮下注射镇痛药物（丁丙诺啡缓释 0.6mg/kg）；
（2）皮下注射10ml/kg 0.9%生理盐水，腹部剃毛，用聚维酮碘和70%乙醇清洁皮肤；
（3）使用10号外科手术刀在腹部切开一个2-2.5cm长的切口；
（4）用棉签将肠管和结肠拉至右侧腹部，用浸泡在0.9%生理盐水中的无菌纱布覆盖，保持脏器湿润；
（5）暴露主动脉和左肾动脉，用钝性解剖弯钳和无菌棉拭子分离左肾上下腹主动脉和左肾动脉与静脉、脂肪和周围结缔组织；
（6）在主动脉下面缝4-0线，用微血管夹夹住主动脉上方(肠系膜上动脉下方)和肾动脉分叉下方；
（7）用24 G静脉导管在左肾动脉分叉水平穿刺主动脉，并将导管推进肾动脉；
（8）注射器与导管连接，将病毒液注入肾脏；
（9）灌注后立即用微血管夹夹住左肾静脉和左输尿管，拔除导管。然后，将一块可吸收止血明胶海绵和一小滴组织粘合剂放在主动脉穿刺区域，用棉签轻轻按压；
（10）在左肾动脉分叉下方，从腹主动脉释放钳夹，5 min后，从肾静脉和输尿管松开钳夹；
（11）从左肾动脉分叉上方的主动脉上松开钳夹，全肾缺血时间不应超过7分钟，确保没有活动性出血发生；
（12）腹部切口分两层缝合（肌肉和皮肤），采用4-0可吸收缝线缝合。
视频教程：
https://www.jove.com/cn/t/54418/intravascular-delivery-of-biologics-to-the-rat-kidney
肾静脉注射操作步骤[3]
（1）4%异氟醚麻醉小鼠，使小鼠呈仰卧姿势于操作台上；
（2）小鼠左腹剃毛，在左腹部切开一个1-2cm的切口，暴露左肾，找到肾静脉；
（3）用显微止血夹夹住肾静脉远端以阻止病毒原液流出肾脏；
（4）用30G注射针刺入左肾静脉近端，将100μl AAV（滴度1×1012vg/ml）注入肾静脉；
（5）5min后，拔出注射针，移去显微止血夹并压迫止血片刻，切口分两层缝合（肌肉和皮肤）。
图2 肾静脉注射示意图[3]
经输尿管肾盂逆行注射操作步骤[4]
（1）4%异氟醚麻醉小鼠，使小鼠呈仰卧姿势于操作台上；
（2）小鼠左腹剃毛，在左腹部做一个2cm的切口，暴露左肾，找到输尿管远端和肾动脉并用显微止血夹夹住；
（3）用 30G注射针刺破输尿管，将注射针贴合于管壁并固定到位，使用 6-0缝线缝合以防液体泄漏；
（4）将尿液吸出，用30G注射针将100μl AAV（滴度1×1012vg/ml）注入输尿管；
（5）将注射针撤出，并在注射部位的近端放置一个显微止血夹以防液体泄漏；
（6）5min后，移去输尿管远端、近端及肾动脉上的显微止血夹，用6-0缝线将切口分两层缝合（肌肉和皮肤）。
视频教程：
https://www.jove.com/cn/t/52559/a-murine-model-irreversible-reversible-unilateral-ureteric
肾实质注射操作步骤[5]
（1）用氯胺酮和噻嗪麻醉小鼠，使小鼠呈仰卧姿势于操作台上；
（2）小鼠左腹剃毛，在左腹部切开一个约1cm的切口，暴露左肾；
（3）26G 1ml Sub-Q注射器经肾囊壁直接向肾实质缓慢注射病毒液，3-5个点，10-15μl/点；
（4）腹部切口分两层缝合（肌肉和皮肤），采用4-0可吸收缝线缝合。
肾盂注射操作步骤[6]
（1）用氯胺酮和噻嗪麻醉小鼠，使小鼠呈仰卧姿势于操作台上；
（2）小鼠左腹剃毛，在左腹部切开一个约1cm的切口，暴露左肾，并将周围器官和脂肪轻轻分开，使肾盂能够被观察到；
（3）用30G注射针刺入左肾的肾盂（注意注射针头不应刺穿肾盂），将50μl AAV（滴度1×1012vg/ml）注入肾盂中；
（4）针头保持在原地10秒，防止病毒液倒流，然后缓慢取出。
（5）用5-0可吸收缝线缝合动物的肌肉层，用5-0或6-0不可吸收尼龙缝线缝合动物的皮肤层。
视频教程：
https://www.jove.com/cn/t/56324/hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins
表1不同注射方法的感染范围和病毒剂量
以上就是感染肾脏常用的注射方法，AAV2和AAV9两种血清型对肾脏的亲和性较高，另外汉恒生物还可提供肾小管上皮细胞特异性启动子Ksp-cadherin和肾脏足细胞特异性启动子nphs1 等，与合适的血清型搭配使用，感染效果更佳。更多关于肾脏感染的问题欢迎咨询汉恒生物！
参考文献：
[1]D J R,A M B. Improving Molecular Therapy in the Kidney.[J]. Molecular diagnosis & therapy,2020,24(4).
[2]Federico F,Yang X Z,A T W, et al. Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney.[J]. Journal of visualized experiments : JoVE,2016(115).
[3]R P C,J G R,C E L, et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors.[J]. American journal of physiology. Renal physiology,2013,304(9).
[4]E E H,A M V,Peng D, et al. A murine model of irreversible and reversible unilateral ureteric obstruction.[J]. Journal of visualized experiments : JoVE,2014(94).
[5]Jeffrey R,V T N,Kari A, et al. Comparison of Gene Delivery to the Kidney by Adenovirus, Adeno-Associated Virus, and Lentiviral Vectors After Intravenous and Direct Kidney Injections[J]. Human gene therapy,2019,30(12).
[6]E L W,C R W,M F W, et al. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney.[J]. Journal of visualized experiments : JoVE,2018(131).
