近年来，细胞增殖一直是生物医学领域的研究热点。细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下，通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程，其中核DNA的复制倍增是整个过程的重要特征。

细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、药理和药代动力学等研究领域，不仅在研究细胞的基本生物学特征中非常重要，而且是分析细胞状态、研究遗传性状的一种基本方法，可为探讨疾病的发病机制、诊断疾病及治疗疾病提供有价值的资料。

检测细胞增殖的方法目前主要分为代谢活性检测、DNA合成检测、细胞增殖相关抗原检测等。此外，还可以检测ATP等酶活性、钙离子内流、细胞膜完整性等，每种检测方法都存在各自的优缺点，应根据不同的实验目的，尽量选择准确性高、重复性好的检测方法或将多种检测方法结合，从而客观、全面地反映实验结果。

►►►计数法

Part.1 直接计数法

仪器：血球计数板或细胞计数仪

优点：简单、成本低，可用于细胞生长曲线的绘制。

缺点：无法区分活细胞与死细胞，不适合数量较多或特定亚群的细胞计数。

Part.2 染料排斥法

由于细胞膜的选择性，活细胞不允许伊红、台盼蓝、苯胺黑、0.4% 锥虫蓝等透过，只有死细胞才会显色。这种方法无法区分增殖细胞和非增殖细胞，只适合辨别细胞的基础活性（活/死细胞）及其细胞膜的完整性。

►►►克隆形成

在克隆内，细胞和细胞之间的连接比较紧密，一个细胞就能形成一个大的克隆。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

平皿克隆形成试验：适用于贴壁细胞， 如正常细胞和肿瘤细胞；

软琼脂克隆形成试验：适用于肿瘤细胞、 转化细胞和悬浮生长细胞；

不同的细胞克隆形成能力不同：原代培养的细胞克隆形成能力弱，可传代的细胞系强；二倍体细胞克隆形成能力弱，转化细胞系强；正常细胞弱，肿瘤细胞强。

克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）× 100%

►►►细胞代谢活性（比色法）

主要分为MTT/CCK-8/MTS三种方法，原理是利用细胞线粒体内的酶将检测试剂还原为有色产物，随后测量相应的OD值即可，其与细胞活性（数量）成正比。特别适用于高通量筛选和快速获得结果。

Part.1 MTT

MTT中文名称噻唑蓝（淡黄色），可以被活细胞中线粒体内的琥珀酸脱氢酶和细胞色素C等还原为不能溶于水的蓝紫色产物甲臜（formazan），需进一步使用DMSO等有机溶剂溶解后才能检测。MTT通常适用于贴壁细胞的检测，不适合悬浮细胞的检测。

Part.2 CCK-8

使用的是WST-8，它在电子耦合试剂的作用下可以被活细胞线粒体内的脱氢酶还原为高度水溶性的橙黄色甲臜，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。CCK-8可直接加入细胞样品中，因此适合悬浮细胞和贴壁细胞的检测。对细胞几乎没有毒性, 检测完成后的细胞还可以继续培养使用。

►►►DNA合成检测法

DNA的倍增是细胞在增殖过程中最显著的变化之一。直接测定细胞的DNA合成含量，是检测细胞增殖最精确的方法。最常用的方法使BrdU/EdU检测法，应用于细胞DNA修复，分化及细胞标记物追踪等方面。

Part.1 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）

BrdU能够代替正常的胸腺嘧啶参与细胞DNA复制过程，BrdU的特异性抗原可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。缺点是需要对双链DNA进行变性处理（酸变形、热变性等）。

Part.2 EdU（5-乙炔基-2’-脱氧鸟苷）

是BrdU的替代方法，无需特殊条件处理（酸解、热解等）。EdU是一种新型胸腺嘧啶核苷类似物，可以在DNA合成过程中替代胸腺嘧啶掺入到新合成的DNA中。通过点击反应，新合成的DNA会被相应的荧光探针标记，从而可以通过DNA的合成来反应细胞的增殖情况。

Part.3 3H-TdR

又称为放射性核素标记法，需要一定的设备，并且容易造成环境污染，需要特殊处理。胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，用同位素3H标记TdR后即可成功参与DNA合成代谢过程。通过测定细胞的放射性强度，来检测细胞的增殖情况。

►►►ATP含量测定

死细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，ATP与活细胞数目具有良好的线性关系。当细胞死亡时，ATP会迅速水解，借助ATP依赖的荧光素酶（Luciferase）催化的萤火虫荧光素（Luciferin）发光反应测量其发光值，发光值与ATP量成正比。此方法适合高通量筛选检测。

►►►荧光探针法

目前主要分为两种：CFDA-SE和Calcein AM。

Part.1 CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）

是一种可穿透细胞膜的荧光染料。能够被动扩散进入细胞，其本身不具备荧光，直至被细胞内非特异性酯酶水解以产生荧光，它既可用于细胞示踪，也可用于细胞增殖检测。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通常用FITC通道检测。

Part.2 Calcein AM（钙黄绿素乙酰氧基甲酯）

增强的疏水性使其能够轻松穿过细胞膜，穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Calcein，从而被滞留在细胞内，发出强绿色荧光。Calcein  AM的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。因此，Calcein AM是目前最理想的活细胞荧光探针之一。Calcein-AM常常与死细胞荧光探针PI（Propidium iodide）联合使用，检测细胞毒性和凋亡。

►►►发光活细胞

CellTiter-Glo（CTG）是基于ATP检测的快速细胞活力检测法(原理如下图)，是公认的高灵敏度发光检测法，是细胞活力检测的金标准，在国内外被广泛应用。一步法，均质检测，操作时间只需要10min。

►►►其他相关增殖指标检测

可通过免疫组化的方法检测增殖细胞特异性表达的某些特定蛋白，如增殖细胞核抗原PCNA，细胞核相关抗原Ki-67和微小染色体维持蛋白MCM等。Ki-67是检测比较多的增殖指标，既可以免疫组化检测也可以流式检测，流式检测的时候需要破核。

以上就是检测细胞增殖的方法分类，大家要根据自己的实验方案和需求选择合适的实验方案。

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