如何从FFPE样本中获得高质量核酸

什么是FFPE样本

FFPE（Formalin-fixed paraffin-embedding）即用福尔马林将组织或细胞固定后用石蜡包埋，是一种组织或细胞保存技术。福尔马林中的甲醛可以与蛋白质的氨基结合，使蛋白质凝固变性，保持组织细胞结构的完整性 [1]。通过FFPE技术处理得到的样本我们称为FFPE样本，因实际使用时会切成薄片，也称石蜡切片。

FFPE样本的应用

这项技术长期以来在临床检验、医学科学研究中得到广泛应用，尤其是细胞形态学研究和肿瘤病理学研究，如：HE染色、免疫组化及荧光原位杂交等。随着分子生物学的发展，FFPE样本在分子诊断及研究的应用需求越来越多。目前在NGS医检所中，除去血液样本，接收的所有组织样本几乎均为蜡块、白片、蜡卷等FFPE样本。为了保证NGS实验数据的准确性与真实性，从FFPE样本中纯化出高质量的核酸十分重要。

影响FFPE样本中核酸质量的因素

一般核酸提取纯化有三个质检指标：核酸浓度、核酸纯度及核酸完整度，而FFPE样本由于福尔马林处理，损伤核酸，影响下游应用数据的真实性，提高了核酸提取难度。

一般来说FFPE 样本可以保存长达数年时间，但超过一年的FFPE样本不建议用于NGS实验。即使在一年内，随着保存时间的增加，DNA的片段化也会加剧，因此应用于NGS检测的FFPE样本应该在采样后尽快完成实验。

FFPE样本制备及核酸纯化处理

要想从FFPE样本中提取纯化出高质量的核酸，首先需要得到高质量的FFPE样本，从FFPE样本的制备到核酸的提取，我们需要注意以下几点。

FFPE样本的制备

01.样本的选择

FFPE可以采用新鲜组织样本或细胞样本进行制备。对于肿瘤病理组织样本而言，目的是研究肿瘤细胞，因此在活检或手术取组织样本时肿瘤组织的占比一般要大于20%以上[2]，并在取样后要用生理盐水冲洗，避免血液中gDNA污染。周围炎症严重的肿瘤细胞、黏液产生过多的肿瘤细胞、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果。手术采样的肿块组织不低于50mg，穿刺采样应≥2条，长度≥0.5 cm[3]。

02.福尔马林固定

a.组织新鲜。务必在组织离体后30min内浸入适量组织固定液中进行固定。

b.适当的固定液。液体与组织大小比例为10:1，应当使用中性的福尔马林缓冲溶液，避免使用酸性及含有重金属离子的固定液，目前市面上有使用多聚甲醛代替。

c.适当的固定时间。时间较短可能导致标本较深处组织未渗入福尔马林，而发生核酸和蛋白降解。固定时间过长则导致更密集的交联，让核酸和蛋白的提取变得更加困难。体积较大的标本应充分固定至6-48h，但不超过72h，小活检标本固定6-12h即可[4]。

新鲜组织放入RNA保护液作为对照组，福尔马林分别固定20h和72h并进行石蜡包埋作为实验组，利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。并使用一步法RT-PCR验证。扩增子大小如图所示，RT-PCR的结果以颜色显示：红色表示无扩增，黄色表示弱的扩增，绿色表示成功的扩增。尽管较长时间的固定对RNA片段化和核糖体条带影响甚微，但较长扩增子的扩增效率差。推测由于RNA分子的过度交联和较高比例的不可逆交联导致。

d.合适的组织大小。福尔马林大约以1 mm/小时的速率渗透组织，通常建议固定最多5 mm厚的组织标本。

将大鼠的肾与脑组织整个器官（whole）与≤4 mm的器官切片（cut）分别进行福尔马林固定和石蜡包埋。左图包埋后3天纯化RNA，并利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。在整个脑组织（whole Brain）的电泳峰图中，双箭头指出了18S rRNA和28S rRNA的峰减少，表明RNA片段化的增加。右图纯化的RNA被用于一步法RT-PCR中，从左到右，扩增子大小分别为96nt、206nt、400nt、613nt和785nt。从图可以看出较大片段的RNA存在降解。

FFPE样本的核酸纯化

01.脱蜡（脱蜡要彻底）

因为FFPE样本的特殊性，石蜡会阻碍消化液对组织的渗透，抑制蛋白酶K对组织内蛋白质的消化，从而影响核酸的释放。为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，对组织进行彻底的脱蜡十分重要。传统的脱蜡方式为二甲苯脱蜡，二甲苯脱蜡不仅容易造成核酸片段化和得率低，而且对人有毒害，切片越厚或存放时间越长，脱蜡效果越差。目前市面上主流方案是采用无毒脱蜡液，以及Covaris的超声乳化脱蜡。

02.组织消化

为了将DNA与结合的蛋白质分离，FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶，这个步骤还可防止DNA发生降解。对消化时间进行优化十分重要。消化的时间过短，DNA的释放不充分，导致核酸提取的得率低。消化时间可以根据组织类型、组织大小进行调节，使DNA充分释放。

03.解交联

由于FFPE样品包含的DNA分子会彼此交联，并与RNA和蛋白质分子交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。建议在80℃的环境下，孵育样品一个小时，以达到逆转交联的目的。

福尔马林固定导致核酸之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间的交联。固定时间越长，交联程度越大，纯化难度越大。

04.核酸的提取

核酸的提取有多种成熟的方法，包括酚氯仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等，各方法在提取FFPE样本核酸时没有太大差异，只需要根据自己的实验需要选择即可。

05.质控

对提取出来的核酸进行质控十分重要，对于FFPE样本中提取的核酸，通过吸光度检测样品纯度（Nanodrop），荧光定量（Qubit）及毛细管电泳仪进行测定核酸浓度、OD值（纯度）及片段大小（DIN），除此之外还可参考Alu247/Alu115和Q Score。

Alu247/Alu115：Alu序列是广泛分布于人基因组的约300bp短重复序列。通过长（247 bp; Alu247）、短（115 bp; Alu115）扩增子比值可评估gDNA的完整度。

Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR扩增产物浓度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分别指129bp和41bp产物、305bp和41bp产物浓度比值。

FFPE样本的在NGS中应用

上面有提到由于福尔马林的固定导致FFPE样本提取核酸存在的问题，如DNA断裂、胞嘧啶（C）脱氨基、无碱基位点的产生等，均可能导致得到错误的核酸信息，特别是脱氨基导致的C:G > T:A人为突变。而这些不真实的DNA信息导致形成FFPE DNA序列伪影（sequence artifacts）。序列伪影是由固定、包埋等过程人为引入的序列突变[6]，具体表现为NGS结果中DNA序列出现了一些在固定之前不存在的碱基变化，这些人为突变使NGS检测出现假阴性和假阳性的问题。Lamy和他的同事研究发现，在993例福尔马林固定的结直肠癌中，有53例（5%）存在KRAS基因密码子12和13人工变异(14例)。

虽然FFPE在NGS检测中存在伪影的问题，但FFPE样本的易保存性以及临床中与病理紧密关系使这种类型样本的应用仍有很大优势，那如何提高FFPE样本在NGS检测中的准确度呢？在降低FFPE样本中DNA的损伤方法中总结如下图：

总结

如何从FFPE样本中提取出高质量的核酸，下图对本文重点进行总结：

参考文献

[1] M j C, W L, L D, X L. Tissue Requirements and DNA Quality Control for Clinical Targeted Next-Generation Sequencing of Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Samples: AMini-Review of Practical Issues. Journal of Molecular and Genetic Medicine.2017;11(2).

[2] 中国临床肿瘤学会非小细胞肺癌专家委员会. 二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版)[J]. 中国肺癌杂志, 2020(9).

[3] Benson AB 3rd, Venook AP, Bekaii Saab T, et al．Rectal cancer, version 2. 2015[J].J Natl Compr Canc Netw, 2015, 13(6):719728．

[4] 王恩华, 朱明华等. 非小细胞肺癌靶向药物治疗相关基因检测的规范建议[J]. 中华病理学杂志, 2016, 45(002):73-77.

[5] von Ahlfen S, Missel A, Bendrat K, Schlumpberger M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One. 2007 Dec 5;2(12):e1261. doi: 10.1371/journal.pone.0001261. PMID: 18060057; PMCID: PMC2092395.

[6] Do H, Dobrovic A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin Chem. 2015 Jan;61(1):64-71. doi: 10.1373/clinchem.2014.223040. Epub 2014 Nov 24. PMID: 25421801.

[7] Lamy A, Blanchard F, Le Pessot F, Sesboüé R, Di Fiore F, Bossut J, Fiant E, Frébourg T, Sabourin JC. Metastatic colorectal cancer KRAS genotyping in routine practice: results and pitfalls. Mod Pathol. 2011 Aug;24(8):1090-100. doi: 10.1038/modpathol.2011.60. Epub 2011 Apr 22. PMID: 21516079.