USP19调节癌细胞迁移和侵袭，并作为早期乳腺癌患者的新型预后标志物

写在前面

        今天推荐的是由阿根廷皮拉尔市布宜诺斯艾利斯大学在2021年3月13日发表于Oncogenesis（2020IF：7.4847，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是MarioRossi教授，研究表明USP19调节癌细胞迁移和侵袭，并作为早期乳腺癌患者的新型预后标志物。

研究背景

        癌症患者体内的肿瘤细胞扩散与其存活率和生活质量显着降低有关。泛素化途径在正常和应激条件下维持蛋白质稳态方面发挥着重要作用，其失调与肿瘤细胞的恶性转化和侵袭能力有关，因此突出了其作为潜在治疗靶点的价值。

摘要部分

        为了鉴定肿瘤细胞迁移和侵袭的新分子靶标，作者使用针对泛素化途径相关基因的shRNA文库进行了遗传筛选。作者鉴定了去泛素化酶USP19，并证明其沉默降低了高侵袭性乳腺癌细胞系的迁移和侵袭潜力。作者还进行了体内研究并证实注射USP19敲低细胞的小鼠显示出无肿瘤存活率增加，以及肿瘤形成的发生延迟和转移灶的出现显着减少，表明肿瘤细胞侵袭并且传播受到影响。相比之下，USP19的过表达增加了体外和体内的细胞侵袭性，进一步验证了作者的发现。更重要的是，作者证明了USP19催化活性对于控制肿瘤细胞迁移和侵袭很重要，并且其分子作用机制涉及Wnt辅助受体LRP6。最后，作者发现USP19过表达是早期乳腺癌患者复发的替代预后标志物。总之，这些发现表明USP19可能代表乳腺癌的新治疗靶点。

研究内容

1.基于迁移的筛选以识别具有新调节功能的泛素化途径基因     

        为了在泛素化途径中鉴定新的细胞迁移正调节因子，作者进行了基于shRNA的功能选择筛选。一个针对400多个人类泛素化相关基因的重组慢病毒shRNA文库被稳定转导到乳腺癌细胞中。功能选择的方法为将混合种群放入transwell单元的上部隔室，并允许通过穿孔膜迁移到下部隔室，分离并扩增表现出迁移减少的细胞。作者将得到的细胞循环进行该方法，直到细胞失去了大约80%的迁移潜力。在每个循环之后，作者通过PCR扩增和基因组DNA的定量测序来评估细胞群中shRNA的相对丰度。随着循环周期的增加，作者观察到shRNA的数量显着减少，表明选择过程是有效的。作为对照，作者使用了空载体转导的细胞系。

        在选择过程之后，作者分析工作流程来选择候选基因以进行进一步验证。作者鉴定出30个基因，它们的敲低改变了迁移。这些基因中有一半已经与迁移、侵袭、转移或肿瘤发生相关，并作为作者筛选的可行性和特异性的证明。在确定的候选者中，作者将注意力集中在去泛素化酶USP19的研究上。

研究结论：作者通过筛选，确定了USP19与细胞迁移有关

2.验证USP19作为细胞迁移的调节剂

        为了验证USP19作为细胞迁移的潜在调节剂，作者建立了稳定的MDAMB231细胞系，这些细胞系用针对USP19表达的shRNA进行处理，并成功敲低了USP19的表达。接下来，作者使用transwell迁移和伤口愈合试验来确认USP19敲低对细胞运动的影响。USP19敲低显着降低了细胞相对于对照细胞系的迁移潜力。对伤口愈合试验的分析也表明，USP19敲低细胞中伤口边缘细胞的速度和总位移显着降低，并且相对于对照细胞，它们的持久性增加。

研究结论：USP19沉默影响体外细胞迁移。

3.敲低USP19可以降低肿瘤侵袭

        细胞运动性通常与肿瘤细胞侵袭增加有关，并且是侵袭性肿瘤细胞的特征。因此，作者决定研究USP19敲低对肿瘤细胞侵袭的影响。为此，作者首先分析了细胞侵入琼脂斑点的能力。作者的结果表明，与对照细胞系相比，USP19敲低显着减少了入侵细胞的数量及其总位移。作者接下来进行了集落形成实验，与USP19沉默的细胞系相比，对照细胞系形成更大的集落，表明在这些条件下，USP19表达降低的细胞中的增殖、侵袭和不依赖贴壁的生长受损。

研究结论：USP19敲低抑制了体外肿瘤细胞的侵袭。

4.敲低USP19可以降低肿瘤侵袭

        作者用USP19过表达质粒稳定转染MCF7细胞，然后进行伤口愈合试验。与对照细胞系相比，USP19过表达诱导间隙覆盖面积显着增加。作为对照，作者过表达USP19的催化突变踢和缺少USP19跨膜结构域的突变体。与USP19野生型相比，作者没有检测到这些突变体中细胞迁移的增加。这一结果进一步支持了USP19是迁移的正调节因子的假设，并提供了证据表明这种表型取决于其催化活性和亚细胞定位。接下来，作者分析了USP19过表达对重组细胞外基质的侵袭和生长的影响。当将野生型USP19过表达细胞与对照细胞系进行比较时，作者观察到集落面积显着增加。

研究结论：USP19野生型过表达增强了MCF7细胞的迁移和侵袭，另一方面，USP19依赖性的侵袭增加取决于其催化活性和跨膜结构域的存在。

5.USP19调节体内侵袭

        为了进一步表征USP19依赖的体内细胞侵袭调控，作者首先在雌性小鼠的乳腺脂肪垫中皮下注射对照或USP19沉默的MDAMB231细胞。肿瘤生长曲线分析表明，由对照细胞产生的细胞比源自USP19沉默细胞的细胞体积明显更大。此外，无肿瘤存活率的Kaplan-Meier曲线表明，表达USP19 shRNA的细胞产生的肿瘤较少。其次，作者分析了USP19在调节肿瘤细胞肺定植中的作用。为此，作者通过尾静脉注射接种对照或USP19沉默的MDAMB231细胞，并在两个月后收获肺。通过苏木精和伊红染色的肺切片中的人类DNA定量和转移负荷定量实验发现，USP19敲低抑制了体内肿瘤病灶的形成。最后，作者使用MCF7细胞重复了相似的探究。作者在雌性小鼠中皮下注射对照细胞或表达USP19的野生型或催化突变体的细胞。与作者的体外实验一致，野生型USP19表达细胞在所有注射的小鼠中形成肿瘤，而注射表达催化突变体的细胞的小鼠没有显示出肿瘤生长的迹象。

研究结论：USP19对体内定植和肿瘤生长很重要。此外，作者的结果表明USP19催化活性和跨膜结构域是其对细胞运动的刺激作用所必需的。

6.USP19调节乳腺癌细胞中的LRP6蛋白水平

        为了研究USP19影响细胞迁移和侵袭的调节机制，作者使用数据集对乳腺癌mRNA表达进行了计算机分析。作者的结果表明，USP19的高表达水平与Wnt通路的激活相关。这一结果与之前的观察结果一致，表明USP19稳定了LRP6，一种Wnt通路辅助受体，并且这种相互作用影响了下游的Wnt信号。基于这些结果，作者分析了USP19基因修饰后LRP6蛋白的稳态水平。作者的结果表明，在MDAMB231中沉默USP19后，LRP6蛋白水平下降，而在WT USP19过量表达的MCF7细胞中则增加，但在表达催化死亡或细胞质突变版本的细胞中则没有。为了测试USP19和LRP6之间的功能关系，作者随后分析了LRP6内源性沉默对过表达USP19的MCF7细胞的影响。作者的结果表明，野生型USP19诱导的迁移增加被LRP6 shRNA稳定表达逆转。

研究结论：USP19/LRP6信号通路，而非USP19的表达水平，是调节乳腺癌细胞迁移潜力的关键。

7.USP19在早期乳腺癌患者中表达的生存分析

        最后，作者分析了早期乳腺癌患者队列研究中的USP19蛋白表达。Kaplan-Meier图显示，USP19的过表达与DRFS的频率明显降低有关，而与DFS没有明显的相关性。对DRFS进行多变量分析，并对其他预后因素进行调整，发现USP19高是DRFS的一个独立预后预测因素。

研究结论：USP19代表了早期乳腺癌患者的一个新的预测因素。

结论与讨论

        为了验证USP19作为迁移和侵袭的正调节因子的功能，作者进行了一系列体外和体内实验，分析USP19在定植和肿瘤形成中的作用。此外，作者发现USP19过表达及诊断与早期乳腺癌患者的复发有关。总的来说，作者的数据表明USP19在乳腺癌细胞扩散中起着至关重要的作用。同时，作者提供了新的证据，表明USP19可以成为预后标志物和开发新治疗策略的候选者。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41389-021-00318-x