单细胞测序揭示前列腺癌亚克隆演化

近期，中科院基因组所慈维敏研究员团队在 Advanced Science 发表了题为“Single-Cell RNA-seq Reveals a Developmental Hierarchy Super-Imposed Over Subclonal Evolution in the Cellular Ecosystem of Prostate Cancer”的研究成果。通过对 14 例未经治疗的前列腺癌原发肿瘤进行检测分析，构建了前列腺癌单细胞图谱，系统分析了不同亚克隆的进化方向，并通过分析 TCGA 数据发现肿瘤细胞转录异质性和细胞生态多样性与患者的不良预后相关。该研究中单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。

【发表期刊】Advanced Science

【影响因子】16.806

【检测技术】10x Genomics 单细胞转录组测序

研究背景

前列腺癌（PCa）目前仍是全球男性第二大常见癌症，自 2000 年起，我国前列腺癌症确诊患者以每年 12.6% 的增长率迅速攀升，并且晚期和转移性前列腺癌的确诊率逐年稳步攀升，亟需针对性的治疗策略。但肿瘤包含有不同种类的细胞，它们具有不同的遗传和表型特性，可在肿瘤的发展、转移和耐药过程中起到不同的促进作用，因此需要进一步了解前列腺癌异质性以帮助医务工作者找到更为有效的治疗策略。

研究路线

研究结果

1、利用单细胞测序构建前列腺癌肿瘤生态图谱

为了解 PCa 肿瘤生态系统，研究人员利用 10x 单细胞转录组测序技术对 14 例未经治疗的 PCa 原发灶样本进行检测，分析获得 9 种主要的细胞类型，包括 B 细胞、内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、NK 细胞、T 细胞、成纤维细胞和一群未定义的细胞。并发现在 PCa 患者样本中，T细胞、上皮细胞和内皮细胞的占比高。

为进一步了解 PCa 细胞间的异质性，研究人员利用 inferCNV 分析得到了 20681 个恶性细胞和 2802 个正常的前列腺上皮细胞，通过无监督聚类分析肿瘤细胞的异质性获得 4 个肿瘤细胞亚群，其中亚型 0 是一类上皮间质转化样（EMT-like）细胞，亚型 1 为管腔 A 样（luminal A-like）细胞，亚型 2 同事具有管腔 B 样（luminal A-like）和管腔 C 样（luminal C-like）细胞信号，亚型 3 为基底样（basal-like）细胞。为了了解不同患者来源的样本中肿瘤细胞亚克隆情况，研究人员进一步分析了这 4 种肿瘤细胞亚群在每个样本中的占比情况，发现每个患者的样本中都有 1-2 种亚型占主导地位，表明在肿瘤进化过程中不同的肿瘤亚克隆会存在异质性的优先取向。

2、不同肿瘤亚型和亚克隆内肿瘤细胞周期和发展阶段异质性分析

细胞周期分析结果显示，只有一小部分肿瘤细胞增殖，且 0 亚型的增殖率高于其他 3 个亚型。研究人员还发现不同亚克隆和不同患者之间的细胞增殖状态存在很大的异质性，在一个具有代表性的患者中，倾向于 0 亚型的亚克隆比其他亚克隆有更多的增殖细胞。

进一步利用 Monocle 对癌细胞进行拟时序分析，结果显示发育层次从亚型 2、3 开始，并向亚型1进展，表明亚型 2、3 的肿瘤细胞分化状态远低于与管腔 A 分化型上皮细胞表现出高度的相似性的亚型 1。GSVA 分析结果显示， EMT、TGFβ 和缺氧通路在亚型 0 中富集，同时也获得了亚型 0 与其他亚型共有的代谢通路。值得注意的是，目前较多研究发现上皮间质转换能够增强细胞的干性和转移能力，而本研究发现的结果与之相一致，即亚型 1 的干性评分值较低，而亚型 0、2 和 3 的干性评分较高，表明肿瘤细胞在亚克隆进化过程中获得细胞周期和发育异质性。

3、不同肿瘤细胞克隆型的表达程序差异

为了探索驱动不同发育亚型的潜在分子基础，我们接下来使用单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）来识别每种肿瘤亚型中的潜在调控网络。分析发现每种肿瘤亚型受相关的转录因子（TF）驱动，并且在各亚型中还发现了受关键转录因子调控的 marker 基因上调表达。此外，研究人员还发现每个亚型的经典标记和相关 TF 的表达也与 TCGA 数据库中 PCa 患者队列显著相关。更重要的是，肿瘤细胞的异质性发育亚型也通过患者肿瘤切片样本的免疫组化结果得到证实。

4、恶性细胞中的细胞可塑性可能与肿瘤微环境有关

肿瘤微环境可能会驱动不同克隆型或肿瘤亚型的可塑性，因此研究人员利用 cellChat 分析了细胞之间的通讯网络。结果发现内皮细胞、T 细胞、巨噬细胞和成纤维细胞是主要的通讯枢纽。此外，中期因子（Midkine）、巨噬细胞迁移和抑制因子（MIF）和VISFATIN /烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）信号通路是最多的相互作用通路。

为了评估肿瘤内亚克隆是否通过与肿瘤生态系统中其他空间共定位细胞群的通信来塑造其发育亚型，将肿瘤细胞分别评估为亚克隆或亚型。值得注意的是，亚型 0 细胞无论是细胞群内还是与其他细胞群之间的通讯强度均较弱。这些结果与已知的 EMT 可塑性一致，包括丧失细胞-细胞间的强烈接触、细胞极性和不动性。由于亚型 0 肿瘤细胞占比显示出肿瘤间异质性，因此研究人员进一步对其他患者数据进行分析，发现这一现象具有普遍性。随后，研究人员分析了 PCa 患者中不同肿瘤克隆型与其他基质细胞间的通讯强度，发现这些细胞之间的通讯强度明显不同，进一步分析不同肿瘤亚克隆内部的细胞通讯强度，发现不同亚克隆中 MK 和 MIF 信号通路存在显著差异，这些都表明不同的基质细胞类型可以与不同的肿瘤亚克隆相互作用，从而解释不同的肿瘤行为。

5、肿瘤细胞转录组异质性和细胞生态系统多样性与不良预后相关

为了评估了肿瘤内细胞生态系统异质性和肿瘤细胞转录组异质性是否可能推动疾病进展，研究人员分别建立了两套打分系统以量化肿瘤异质性的不同方面。首先，研究人员使用 CIBERSORTx 算法，根据本研究中 scRNA-seq 数据集对 TCGA 队列中 4 种肿瘤转录亚型的组成进行去卷积，无监督聚类分析发现了两个群，其中1群中亚型 0 恶性细胞比例更高，而 2 群中亚型 1、2 和 3 的比例则更高。此外，1 群中患者的无进展生存期明显低于 2 群中的患者，这表明转录亚型 0 与较差的预后相关。考虑到肿瘤微环境中不同细胞类型之间的广泛相互作用，研究人员假设肿瘤细胞生态系统的多样性可能会影响肿瘤亚型的异质性，并基于此利用香农多样性指数（SHDI）来评估肿瘤亚型异质性与肿瘤生态系统细胞多样性之间的相关性。分析发现肿瘤亚型异质性与肿瘤生态系统中的细胞多样性之间存在正相关，表明肿瘤生态系统的细胞复杂性可能通过细胞通讯塑造肿瘤的亚型成分，从而影响患者的生存。此外，研究人员还利用 CIBERSORTx 推断的肿瘤生态系统中的细胞多样性进行了无监督聚类分析，并确定了两个集群 Div-High 和Div-Low。Div-High 比 Div-Low 具有更大的细胞多样性，并且上皮细胞显着减少，但内皮细胞、B 细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和中性粒细胞显着增加。值得注意的是，Div-High 组患者的无进展生存期明显低于 Div-Low 组患者，表明较高的肿瘤细胞生态系统多样性也与较差的预后相关。总而言之，较高比例的亚型 0 肿瘤细胞和较高的肿瘤生态系统细胞多样性与较差的预后相关。

研究结论

本研究通过对 14 名未经治疗的 PCa 患者进行单细胞转录组测序，构建了 PCa 患者的单细胞图谱，并将细胞发展阶段映射到肿瘤亚克隆进化上。同时研究人员还在 PCa 患者中鉴定出 4 种不同的肿瘤亚克隆。通过分析发现不同亚克隆与肿瘤生态系统中的其他细胞类型显示出不同的通信强度，这可能会调节亚克隆的不同转录亚型。此外，通过整合 TCGA 数据，研究人员还发现肿瘤细胞转录异质性和细胞生态系统多样性都与预后不良的特征相关。

参考文献：

Ge Guangzhe, Han Yang, Zhang Jianye et al. Single-Cell RNA-seq Reveals a Developmental Hierarchy Super-Imposed Over Subclonal Evolution in the Cellular Ecosystem of Prostate Cancer. Adv Sci (Weinh),  2022, 9:  e2105530.