Fast T4 DNA Ligase丨快速T4 DNA连接酶使用方法说明

T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）的主要功能是连接DNA分子的断裂端。在DNA复制、重组或修复过程中，DNA链可能会发生断裂或切口，T4 DNA连接酶能够催化DNA分子的5'磷酸基和3'羟基之间的磷酸二酯键形成，从而将DNA片段连接起来，类似于生物界的“502”。除了连接DNA分子的断裂端，T4 DNA连接酶还可以封闭单链RNA或DNA/RNA杂交链中的切口，因此在修复RNA或DNA/RNA杂交链的损伤时也能发挥作用。T4 DNA连接酶是一种重要的酶，在分子生物学研究和基因工程应用中发挥着关键的作用，用于连接DNA片段、构建重组DNA分子和修复DNA损伤等。   Biogradetech的T4 DNA连接酶由携带T4噬菌体gene 30的大肠杆菌产生。该酶催化双螺旋DNA或RNA之间的5'-磷酸基团和3'-羟基之间形成磷酸二酯键。该酶在双链DNA、RNA 或者DNA/RNA复合物间可修复单链缺刻，并且可以连接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但对于单链核酸无活性，主要用于限制性内切酶酶切产物DNA片段克隆、基因定点突变与 PCR产物克隆、线性DNA自环化与修复双链DNA缺刻。T4 DNA Ligase需要 ATP 作为辅助因子，在室温下完成粘性末端连接反应仅需10分钟。   艾美捷Fast T4 DNA Ligase 快速T4 DNA连接酶： 货号 C-BSM205-1000U 名称 Fast T4 DNA Ligase 快速T4 DNA连接酶 组分 T4 DNA Ligase(Fast) (5 U/ul) 200ul 10×T4 DNA Ligase Buffer   1ml 50% PEG                 1ml   Fast T4 DNA Ligase 快速T4 DNA连接酶使用方法： 1.DNA 插入片段连接至载体DNA（粘性末端连接） ① 于冰上配制如下反应体系： 试剂 用量 线性化载体 DNA 20~100 ng 插入片段 DNA 3:1~10:1 (片段：载体摩尔比) 10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul T4 DNA Ligase 1U (0.2 ul) Nuclease-Free Water To 20 ul ② 充分混匀并瞬离，22℃温育10 min； ③ 取1~5 ul的连接产物用于50 ul化学感受态细胞的转化，或者取1~2 ul用于50 ul电转感受态细胞的转化。    2.DNA插入片段连接至载体DNA（平末端连接） ① 于冰上配制如下反应体系： 试剂 用量 线性化载体 DNA 20~100 ng 插入片段 DNA 3:1~10:1 (片段：载体摩尔比) 10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul 50% PEG 2 ul T4 DNA Ligase 5U (1 ul) Nuclease-Free Water To 20 ul ② 充分混匀并瞬离，22℃温育1 h； ③ 取1~5 ul的连接产物用于50 ul化学感受态细胞的转化，或者取1~2 ul用于50 ul电转感受态细胞的转化。    3.线性DNA自环化 ① 于冰上配制如下反应体系： 试剂 用量 线性化载体 DNA 10~50 ng 10×T4 DNA Ligase Buffer 5 ul T4 DNA Ligase 5U (1 ul) Nuclease-Free Water To 50 ul ② 彻底混匀并瞬离，22℃温育10 min； ③ 取 1~5 ul的连接产物用于50 ul化学感受态细胞的转化，或者取1~2 ul用于50 ul电转感受态细胞的转化。    4.接头连接 双链寡核苷酸接头经常被用于在插入片段上产生粘性末端。接头通 常包含限制酶识别位点，在连接后经酶切处理产生和克隆载体匹配的粘端。有时候接头已包含与克隆载体匹配的粘端，此时无需在接头连接完 成后进行插入片段的进一步处理。   试剂 用量 线性化载体 DNA 100~500 ng 磷酸化接头 1-2 ug 10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul 50% PEG 2 ul T4 DNA Ligase 2U (0.4 ul) Nuclease-Free Water To 20 ul ② 彻底混匀并瞬离，22℃温育10 min； ③ 在65℃作用10 min或者70℃作用5 min，进行热失活。