杨树苗生理指标的测定
1.叶绿素含量的测定
试剂：95%乙醇（C2H5OH）、石英砂、碳酸钙粉、
实验步骤:
称取剪碎的新鲜样品 0.2～0.3g，加乙醇10ml，提取直至无绿色为止。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。
计算公式: Ca=12.7 A663—2.59 A645
Cb=22.9 A645—4.67 A663
Ca十b＝20.3 A645—8.04 A663
2.过氧化物酶（POD）活性的测定
试剂:
0.05 mol/L PH 7.0的磷酸缓冲液：0.2M A液（Na2HPO4）61ml和0.2M B液（NaH2PO4）39ml混100ml，用去离子水定容400ml 。
储备液A：0.2M Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4*7H2O或71.7g Na2HPO4*12H2O配成1000ml）
储备液B：0.2M NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4*H2O配成1000ml）
愈创木酚、30％H2O2
反应混合液:50ml的0.05mol/L（PH0.7）L磷酸缓冲液中加入28ul的愈创木酚，加热搅拌直至愈创木酚溶解，再加入19ul的30％H202混合。
实验步骤:
（1）酶液提取：清洗干净叶片擦干，称取0.2～0.3 g叶片，剪成小片，放入研钵加入石英砂、及2ml 50mmol的PH 7.0(5.5-7.5)的磷酸缓冲液PBS（0.02-0.1mmol）进行研磨，磨碎后在加入8mlPBS溶液洗涤研钵一并装入离心管内，4℃下4000rmin-1离心15min，收集上清液4℃保存备用。
（2）显色反应
过氧化物酶活性（△OD470/(min.g)） =（△A470×VT）/（W×VS×0.01×t）
式中：△A470为反应时间内吸光度的变化，W为叶片鲜重g，t为反应时间min，Vt为提取酶液总体积ml，Vs为测定时取用的酶液体积ml。
3.植物体内游离脯氨酸含量的测定
试剂:
（1）2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中（原液稀释2.3倍），搅拌加热（70℃）溶解，贮于4℃冰箱中，2-3日有效。
（2）3％磺基水杨酸配配制：3.496g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。（3）10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml， 加蒸馏水稀释定容至100ml，即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。
脯氨酸标准曲线的制作:
（1）取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却。以去离子水溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
（2）标准曲线的绘制 以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定:
（1）脯氨酸的提取
称取0.2～0.3g叶片于20ml试管 + 10ml 3％磺基水杨酸溶液→沸水浴10min（提取过程中要经常摇动）→冷却过滤于干净的试管中→脯氨酸提取液。（2）测定 吸取酶提取液2ml + 2ml H2O + 2ml冰醋酸 + 4ml 2.5﹪酸性茚三酮→沸水浴30min→溶液呈红色→冷却→取上层液于比色杯520mm处测定吸光度（A）值。
计算结果
从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝ X×提取液总量（ml）/样品鲜重（g）× 测定时提取液用量（ml）
公式中：X －从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）
4.植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
试剂:
标准蛋白质溶液（100 μg/mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液40 mL ，用蒸馏水稀释至100 mL 即可。
考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ，溶于 50 mL 90 ％乙醇中，加入 100 mL 85％（ W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。
实验步骤:
标准曲线的绘制
取 6 支试管，按下表 加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
样品测定 :
（1） 样品提取 称取鲜样 0.25 ～ 0.5 g ，用 5 mL 蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后， 3000 r/min 离心 10 min ，上清液备用。（2）吸取样品提取液 0.3 mL （视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复 2 次），加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂摇匀，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，测定吸光度，并通过
标准曲线查得蛋白质含量。
样品中蛋白质的含量=（C*V1）/（V2*W*1000） （mg/g）
式中:
C-查标准曲线得ug
V1-提取液总体积 ml
V2-测定时加样量 ml
W-样品鲜重 g
5.根活力的测定
试剂 :
1. 乙酸乙酯（分析纯）。
2. 次硫酸钠（ Na 2 S 2 O 4 ，分析纯），粉末。
3. 1 ％ TTC 溶液：准确称取 TTC 1.0 g ，溶于少量水中，定容到 100 mL 。用时稀释至需要的浓度。
4. 磷酸缓冲液（ 1/15 mol/L ， pH7.0 ）。
5. 1 mol/L 硫酸：用量筒取比重 1.84 的浓硫酸 55 mL ，边搅拌边加入盛有 500 mL 蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至 1000 mL 。
6. 0.4 mol/L 琥珀酸：称取琥珀酸 4.72 g ，溶于水中，定容至 100 mL 即成。
仪器设备
小烧杯 3 个，研钵 1 个，移液管： 0.5 mL 1 支、 10 mL 1 支、 5 mL 3 支，刻度试管 6 支，分光光度计，分析天平（感量 0.1 mg ），电子顶载天平（感量 0.1 g ），温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。
实验步骤：
1. 定性测定
（ 1 ）配制反应液 把 1 ％ TTC 溶液、 0.4 mol ／ L 的琥珀酸和磷酸缓冲液按 1:5:4 比例混合。
（ 2 ）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置 37 ℃左右暗处放 1 ～ 3 h ，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。
2. 定量测定
（ 1 ） TTC 标准曲线的制作 取 0.4 ％ TTC 溶液 0.2 mL 放入大试管中，加 9.8 mL 乙酸乙酯，再加少许 Na 2 S 2 O 4 粉末摇匀，则立即产生红色的 TTF 。此溶液浓度为每毫升含有 TTF 80 μg 。分别取此溶液 0.25 mL 、 0.50 mL 、 1.00 mL 、 1.50 mL 、 2.00 mL 置 10 mL 刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含 TTF 20 μg 、 40 μg 、 80 μg 、 120 μg 、 160 μg 的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在 485 nm 波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（ 2 ）称取根尖样品 0.5 g ，放入小烧杯中，加入 0.4 ％ TTC 溶液和磷酸缓冲液（ pH7.0 ）各 5 mL ，使根充分浸没在溶液内，在 37 ℃下暗保温 1 ～ 2 h ，此后立即加入 1 mol/L 硫酸 2 mL ，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品， 37 ℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。
（ 3 ）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯 3 ～ 4 mL ，充分研磨，以提出 TTF 。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤 2 ～ 3 次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为 10 mL ，用分光光度计在波长 485 nm 下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出 TTC 还原量。
结果计算:
根系活力= C/(1000*W*h) [mg TTF/（g•h）]
式中：C——四氮唑还原量,μg.
W——根重,g.
h——时间,h.
6.根中过氧化氢酶的测定
试剂:PH7.0磷酸缓冲液
实验步骤
（1）酶液提取 取叶片0.2～0.3g加入2ml pH7.0的磷酸缓冲液少量研磨成匀浆，在加缓冲液定容转移至10ml后转入离心管中，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。4℃下保存备用。
（2）测定：取10ml试管2支，其中1号为样品测定管，1号为空白管，按下表顺序加入试剂。25℃预热后，逐管加入0.5ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
（3）结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= A240x´VT/（0.1´V1´t´FW）
式中DDA240=Aso-（As1+As2）/2
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1， AS2—样品管吸光值； Vt—粗酶提取液总体积（ml）； V1—测定用粗酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）； 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
