结果

鉴定与预后相关的差异表达的 ARG 和 ERG

最初，从GeneCards和GSEA下载ARG和ERG，随后分别选择diff-ARG和diff-ERG然后，从TCGA获取COAD患者的临床预后数据，随后使用单变量Cox分析将152个diff-ARG和125个diff-ERG与临床数据结合（P<0.05），最终获得12个与预后相关的ARG （TIMP1、BDNF、IGF1、CDKN2A、MTA1、NAT1、INHBB、CD24、CD36、TRAF2、NOTCH3、PPP2R2A）和 11 个预后相关 ERG（BGN、CXCL1、FSTL3、GPC1、MMP3、OXTR、PCOLCE2、SCG2、SERPINE1、 SERPINH11、TPM2)。此后，测定了TCGA中521个COAD样本（41个正常样本和480个肿瘤样本）中23个基因的表达水平，并独立绘制了箱线图，表明这些基因在健康组织和恶性组织之间存在差异表达。。同时，使用“corrplot”软件包进一步分析和绘制了这 12 个 ARG 和 11 个 ERG 之间与预后相关的相关性。然后，选择桑基图（P<0.05，|cor|>0.3）的基因对，其中正值表示正相关，负值表示负相关。

负相关的API和EPI构建

为了进一步研究ARG和ERG之间的串扰，根据PCA的12个预后相关ARG和11个预后相关ERG计算和量化每个肿瘤组织中的失巢凋亡和EMT水平，并分别定义API和EPI。COAD 患者的 API 和 EPI 之间存在负相关性。随后，根据API和EPI评分，将COAD患者分为四个分子亚型组，即API高+EPI高；API 高 + EPI 低；API 低 + EPI 高；以及 API 低 + EPI 低。预后分析结果表明，与其他三组相比，API Low + EPI High 组患者的生存时间最短。然后，合并其他组COAD患者的数据，与API低+EPI高组进行预后分析，得到相应的p值<0.001。两项分析结果均表明，高失巢凋亡抵抗和高 EMT 水平与不良预后相关。

“API低+EPI高”和“其他”组中DEG的富集分析

随后，对API低+EPI高组的DEG进行分析并与其他组进行比较。基于|FC|的标准 > 1.8，筛选了70个DEG，并绘制了火山图使用聚类热图。使用条形图绘制的KEGG分析表明，两组的DEGS主要富集在“粘着斑”、“病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用”、“ECM-受体相互作用”、“NF-κB信号通路、 ” “IL-17 信号通路”、“趋化因子信号通路”、“细胞因子-细胞因子受体相互作用”、“PI3K-Akt 信号通路”。通过弦图绘制的 GO 分析表明，两组在分子功能 (MF)、生物过程 (BP) 或细胞成分 (CC) 方面存在重大差异。DEGs主要富集在“胶原原纤维组织”、“细胞外基质组织”、“细胞外结构组织”、“抗菌肽介导的抗菌体液免疫应答”、“外部封装结构组织”、“体液免疫应答”、“抗菌肽介导的抗菌体液免疫应答”等方面。体液反应”和“伤口愈合”。根据以下过滤标准，使用多个 GSEA 图描述两组之间的 GSEA 富集分析：FDR<0.25 和 NOM P<0.05。API低+EPI高组中富集的前五位功能是“哮喘”、“ECM-受体相互作用”、“糖胺聚糖生物合成”、“蛋白质消化和吸收”和“系统性红斑狼疮”。其他组中富集的五个主要功能被记录为“抗坏血酸和交替代谢”、“脂肪酸降解”、“氮代谢”、“戊糖和葡萄糖醛酸相互转化”和“蛋白质输出”。

预后 ARG 和 ERG (PAEG) 风险模型的构建、PCA 分析以及临床病理参数的生存分析

为了构建基于失巢和EMT的COAD患者风险模型，将12个与预后相关的ARG和11个与预后相关的ERG结合起来，然后对23个基因进行Lasso回归分析。相应的系数标准通过1000倍交叉验证进行评估。确定最优惩罚参数lambda，并根据最小准则计算相应的系数准则。最后，构建了三mRNA（NAT1、PCOLCE2、CDKN2A）预后风险模型。使用以下公式计算风险评分：风险评分=（-0.135312062940216×NAT1表达）+（0.178733977096469×PCOLCE2表达）+（0.0267778987311829×CDKN2A表达）。根据风险评分值将 COAD 患者分为高风险组或低风险组。然后，GSE17536选择数据集作为测试集进行验证，而选择TCGA数据集（n = 452）作为训练集。风险曲线、散点图和风险热图用于突出 COAD 患者的生存时间、风险评分和三个基因丰度之间的关系，这些关系是使用训练确定的。预后分析的结果显示，与训练中的低风险患者相比，高风险患者的生存期较短（p<0.001和测试集（p=0.006）。此外，ROC曲线用于表征风险模型的特异性和敏感性。对于 1 年、3 年和 5 年风险评分，训练集中的 ROC 曲线下面积 (AUC) 值分别为 0.658、0.684 和 0.680，而测试集的对应值为 0.655、0.633 和 0.634。此外，还使用 Rtsne 包和 ggplot2 包绘制训练集中的 t-SNE 分析图像和测试集，独立。scatterplot3d 程序用于捕获训练的 PCA 分析的 3D 图像和测试集。上述发现强调了一个事实，即高风险和低风险患者在训练和测试集中表现出良好的异质性。最后，根据COAD患者的临床特征（如性别、分期、年龄和TNM分期）在训练集中对COAD患者进行亚分类，并比较亚分类后高危和低危患者的生存时间。KM曲线显示，一些亚组如年龄（≤65岁和>65岁）、性别（男性和女性）、M0（无远处转移的患者）、N0或N 1-2（有或没有淋巴结转移的患者）淋巴结转移），III-IV 期和 T 3-4显示出显着的生存期（P<0.05）

Cox 回归分析和列线图开发

在本研究中，进行了单变量和多变量 Cox 回归分析，以确定风险模型是否可以作为出色的独立预后特征。单变量 Cox 回归分析的结果表明，年龄、T 分期、M 分期、N 分期和风险评分等因素与训练集中的 OS 显着呈正相关。此外，在测试集中，风险评分、等级和 OS 之间观察到了很强的正相关关系。另一方面，对单变量分析中涉及的显着因素进行多变量回归分析表明，训练集中的年龄、M分期、T分期和风险评分等特征与 OS 显着相关，而测试集中的风险评分和等级与 OS 显着正相关。上述研究结果表明，风险预测模型是一种有效且独立的预测因子，优于年龄和 TNM 分期等临床因素。

此后，根据上述发现，本研究开发了列线图，其中包括分期、年龄和风险评分等因素。此外，还绘制了列线图的校准曲线，结果表明所有三个校准曲线（1 年、3 年和 5 年）都接近标准曲线，从而证明了可接受的预测效果。DCA 曲线表明列线图比极端曲线更有利。ROC 曲线表明列线图、年龄、风险和分期的 AUC 值分别为 0.792、0.662、0.606 和 0.730。与风险评分曲线、年龄曲线和分期曲线相比，列线图曲线表现出更大的 AUC 值，表明列线图是更好的预后预测指标。

PAEG 风险模型的免疫浸润分析、MCP 计数器和药物敏感性

早期研究表明，TME 与 COAD 远处转移、免疫治疗反应和药物敏感性有关 ( 22 – 24 )。TME 中存在的基质细胞的含量由基质分数表示。免疫评分表示TME中免疫细胞的含量。高风险患者表现出较高的基质细胞水平，然而，低风险组和高风险组之间的免疫细胞比例没有观察到显着差异。较高的肿瘤纯度与更好的预后相关，因为它表明了组织中存在的肿瘤细胞的比例。低风险组的肿瘤纯度较高。TIDE 评分用于评估恶性样本基因表达谱中肿瘤免疫浸润的潜力，并可以预测对免疫检查点阻断治疗的反应。高危患者表现出细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 排除、癌症相关成纤维细胞 (CAF) 和 CTL 功能障碍的表达增强。然后利用ssGSEA技术研究16种免疫细胞的浸润状态，并得出13种免疫功能的评分，以进一步评估免疫浸润与风险模型之间的关系。低风险患者表现出较高的CD8 + T细胞、Th1细胞、B细胞、Th2细胞和Treg细胞浸润，以及较高的APC_co_inhibition和Cytolytic_activity等免疫功能。另一方面，高危患者在训练集中表现出较高的巨噬细胞浸润水平和Type_II_IFN_response等免疫功能。在测试集中，低风险组表现出较高的免疫功能，如检查点、溶细胞活性、APC_co_inhibition、HLA、T_cell_co_inhibition、炎症促进和T_cell_co_stimulation。他们还显示 aDC、B 细胞、中性粒细胞、TIL、iDC、Th2 细胞、Th1 细胞、CD8 + T 细胞和 Treg 细胞的浸润水平较高。然后采用MCPcounter软件比较两组10个免疫细胞和基质细胞的含量。高风险组含有较多数量的内皮细胞和成纤维细胞，而低风险组含有更多的 B 谱系、细胞毒性淋巴细胞和 NK 细胞。。此外，还评估了高风险组和低风险组中的10种常见免疫检查点分子和24种主要组织相容性复合体（MHC）分子，没有发现显着差异

最后，评估了高危和低危患者对COAD常用治疗药物的敏感性，结果表明，高危患者对吉西他滨的敏感性较高，而低危患者对吉西他滨的敏感性较高。对吉非替尼的敏感性。两组对喜树碱的敏感性没有差异

PAEG 在细胞和组织实验风险模型中的验证

本研究构建了HCT-116和DLD-1等抗失巢凋亡COAD细胞系。然后采用qPCR的方法分别检测亲本组和失巢凋亡抗性组中NAT1、CDKN2A和PCOLCE2的mRNA表达水平。本实验结果表明，在失巢凋亡抵抗组中，NAT1 mRNA 表达水平降低，而 CDKN2A 和 PCOLCE2 mRNA 表达水平升高，由此得出结论：NAT1 可以促进失巢凋亡，而 CDKN2A 和 PCOLCE2 负责失巢凋亡。失巢凋亡抵抗。考虑到 PAEGs 在 COAD 远处转移中的重要作用, 分别选取 4 例无远处转移、肝转移、肺转移的原发 COAD 组织, 检测上述 3 个基因的蛋白表达水平免疫组化。一项早期研究表明，Claudin-1 可以通过上调 ZEB-1 来减弱结直肠癌中 E-钙粘蛋白的表达，进而促进 EMT 并减少失巢凋亡 ( 13）。N-钙粘蛋白也是 EMT 的关键标志物之一。因此，Claudin-1 和 N-钙粘蛋白被用作参考并与三种 PAEG 进行比较。结果提示,与肝、肺转移组织相比,无远处转移组织中NAT1蛋白表达量升高,而肝、肺转移组织中CDKN2A、PCOLCE2蛋白表达量升高。上述研究结果表明，高失巢凋亡抵抗、高 EMT 与 COAD 更远处转移之间呈正相关。