显微镜的使用、细菌的简单染色与革兰氏染色法

（一）简单染色法

        简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。它适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带有负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此，碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更容易于识别。常用做染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

（二）革兰氏染色

        革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

        该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红（沙黄、碱性复红）复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后因为脱水反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

（三）普通显微镜

        普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大。使用油镜时，需在载玻片与镜头之间加滴油，原因（1）.增加照明亮度。（2）.增加显微镜的分辨率。

油镜使用的原理:

       油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。

实验方法:

（一）细菌的简单染色

1. 涂片：

       于洁净的载玻片上滴一滴无菌水，蘸取菌种均匀涂布，涂成极薄的菌膜；

2. 固定：

       手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火3次，此操作过程称热固定，其目的是杀死细菌，使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。待玻片冷却再加染色液；

3. 染色：

        滴加一滴结晶紫染色液于菌膜部位，染色1分钟；

4. 水洗

         倾去染色液，用自来水自玻片一段缓缓流向另一端，冲去染色液，冲洗至流下的水中无染色液的颜色为止；

5. 干燥

     自然干燥或把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高) ，或者用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分；

（二）细菌的革兰氏染色

1.制片（与简单染色相同）

（1）涂菌：于洁净的载玻片上滴一滴无菌水，蘸取菌种均匀涂布，涂成极薄的菌膜；

（2）固定：目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。

2.初染

①初染：于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料；

②媒染：滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗；

③脱色：滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需时30s至lmin)，水洗；

④复染：滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。

3.干燥

       自然干燥或把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高) ，或者用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分。

（三） 显微镜的使用

① 显微镜的准备；

②放置标本：将染色的涂片至于镜台上,先用低倍镜（ 10倍镜）寻找合适的视野;

③找合适的视野：转动粗细准焦螺旋，横、纵移动手柄和调节光圈大小，将观察部位移至视野中央，直至看到清楚的图像；

④加油柏油：从双层瓶中取香柏油加到菌膜位置，

⑤调焦：转换油镜（ 100倍镜）至工作位置，要使物镜浸入香柏油；转动细准焦螺旋和调节光圈大小直至找到清晰物象。

⑥观察：仔细观察细菌形态，描绘细菌形态。（四）显微镜使用完毕后的处理

① 下降镜台，取下玻片；

② 清洁油镜：先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用蘸少许二甲苯擦镜纸擦掉残留的香柏油，最后用干净的擦镜纸擦掉残留的二甲苯。注意擦镜头时向一个方向擦拭。

③ 用擦显微镜的擦镜纸将看后的染色玻片擦干净。

实验方法:

（一）细菌的简单染色

1.涂片

点燃酒精灯，灼烧接种环，灼烧锥形瓶口，取一环无菌水，把水点到载玻片上，灼烧接种环，灼烧培养皿，冷却接种环，蘸取单菌落，把菌点放到玻片上水中

！！！注意：若没有涂抹开，菌都堆在一起，看不到单细胞，导致实验失败。

2.固定

3.染色

把已涂片固定的载玻片放到吸水纸上

吸取结晶紫染液

滴加一滴结晶紫染色液于菌膜部位

染色一分钟

4.水洗

①用自来水自玻片一段缓缓流向另一端

②冲洗至流下的水中无染色液的颜色为止

5.干燥

(二) 细菌的革兰氏染色（Schaeffer-Fulton氏染色法）

1.制片

①涂菌

点燃酒精灯，灼烧接种环，灼烧锥形瓶口，取一环无菌水，把水点到载玻片上，灼烧接种环，灼烧培养皿，冷却接种环，蘸取单菌落，把菌点到载玻片上水中。

！！！注意：若没有涂抹开，菌都堆在一起，看不到单细胞，导致实验失败。

②固定

2.染色

①初染

*滴加一滴结晶紫染色液于菌膜部位染色1min

*用自来水自玻片一段缓缓流向另一端

*冲洗至流下的水中无染色液的颜色为止

*用吸水纸吸掉多余水分

③媒染

*滴加卢戈氏碘液，媒染1min

*用自来水自玻片一段缓缓流向另一端

*冲洗至流下的水中无染色液的颜色为止

*滴上95%乙醇

*摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止脱色30s

－1min

*倒掉多余乙醇

*冲洗至流下的水中无染色液的颜色为止

*吸除多余水分

④复染

⑤干燥

（内容同上）

（三）显微镜的使用

（1）显微镜的准备

（2）放置标本

（3）找到合适的视野

10倍镜下的观察:调整亮度，调整载物台高度，调整粗准焦螺旋，调整光圈大小，调整细准焦螺旋直至看到清楚的图像将观察部位移至视野中央观察。

（4）加香柏油

*转换物镜转换器

*40倍镜下滴加香柏油加到菌膜位置，转换油镜至工作位置。

（5）调焦

（6）观察

仔细观察细菌形态，描绘细菌形态(简单染色）

（7）显微镜使用完毕后的处理

①观察结束后清洗镜头

*取下载玻片

 *撕开擦镜纸

*擦去镜头上的香柏油

！！！注意：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭

*沾取二甲苯

*擦掉残留的香柏油

 *再擦去残留的二甲苯

②收显微镜和载玻片

*关闭电源

*拔下插头

*套上镜套

*擦拭载玻片

 *封存载玻片

五、注意事项

(1) 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。

(2) 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

（3）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

（4）选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。